2020 Fiscal Year Annual Research Report
クラスターDNA損傷の構造変化および修復機構の解明
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19H04273
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
倉岡 功 福岡大学, 理学部, 教授 (60335396)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹立 新人 福岡大学, 理学部, 助教 (20846505)
塩井 成留実 (青木成留実) 福岡大学, 理学部, 助教 (50510187)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 放射線 / クラスターDNA損傷 / 塩基除去修復 / ヌクレオチド除去修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
放射線により生じるDNA損傷は、ゲノムDNAの非常に狭い空間的に複数個密集することがある。このように生じたDNA損傷の「かたまり」（クラスターDNA損傷）は、一般環境中に生じるDNA損傷と比べて、その損傷の密集性から非常に修復され難いと予測されている。また、このクラスターDNA損傷は、最終的にDNA鎖の切断を導き、遺伝子の欠失や挿入さらには転座、そして発がんに関与することが考えられている。
本研究では、ヒトにおける放射線生物影響の新しい理解を生み出すことを目的としている。
具体的には、修復系が明らかになっている既知のDNA損傷の２つをDNA分子の特異的位置に挿入することで、クラスターDNA損傷を模倣し、細胞内でのクラスターDNA損傷の構造変化を生化学的および細胞学的に解析した。
昨年度は，クラスターDNA損を有する新規DNA基質の合成方法を確立し実際に合成を行なった。この方法により一定以上の産物を合成することが可能となった一方，いくつかの改良が必要となった。これはこの合成方法に使用する購入可能な精製タンパク質の純度に問題があり，これを解決するために更なる精製もしくは別の合成手順が必要となった。
加えて，HeLa細胞を大量培養し，細胞抽出液の作製を行なっているが，現在までに十分な濃度を回収できていないことがわかった。これは，様々なタンパク質をすべて含む抽出液が必要であることを示唆している。一方で，細胞学的な観察方法を行うための基質作成は問題なく行われた。こちらの方法を用いて更なる解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
クラスターDNA損傷としてのDNA基質作成に関しては，調整するためのタンパク質の純度が十分ではないため，その活性の確認に時間を消費している。加えて塩基除去修復とヌクレオチド除去修復を同時に観察できるHeLaの細胞抽出液を準備するには，ある一定以上の細胞数を確保する必要があり，この調整に時間がかかっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
修復反応に関しては、クラスターDNA損傷がDNA修復切断されているのかを解析する。さらにDNA修復合成（BERおよびNER）に関しては、放射標識することによって修復合成産物を変性ウレアゲル電気泳動で解析する。両方のDNA鎖に損傷が存在する基質に関しては、両方のDNA鎖が修復のテンプレートになりうるので修復基質に変異が導入されていないかをシークエンス解析により明らかにする。
ヒト細胞抽出液は、修復因子を欠損した細胞をゲノム編集技術CRISPR/CAS9システムによって樹立し、それらの細胞から抽出液を作製し、それぞれのタンパク質を加えることによって、その修復機構を解析する。8-オキソグアニンおよびサイクロブリンを同時に有するクラスターDNA損傷基質においては、どちらの損傷が先に修復されるかを探索する。
細胞学的解析用プラスミドDNA修復基質をDNA修復欠損細胞に導入し、修復をモニターする蛍光タンパク質を検出することで評価する。検出は、蛍光顕微鏡を用いて解析する。DNA修復欠損細胞に関しては、NERが欠損した細胞およびBERを欠損した細胞を用いて、細胞の遺伝的にバックグランドを統一して実験を行う。また、これらの実験において生化学的に解析された内容と一致するかを検証する。
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