2019 Fiscal Year Annual Research Report
底層環境評価への環境DNA手法適用へ向けた各種起源由来DNAの分解動態解析
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19H04290
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
中島 典之 東京大学, 環境安全研究センター, 教授 (30292890)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
飛野 智宏 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 講師 (90624916)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 環境DNA / 底生生物 / 分解 / 捕食者 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
起源試料としてニホンドロソコエビを給餌したマハゼの糞を回収し、分解実験を実施した。5尾のマハゼから10日間で合計5,677 mgの糞が回収され、1個体から１回に排泄される糞量は、45 mg～173 mgの範囲にあり平均116 mgであった。採取したマハゼの糞を一つの容器に入れ、均質になるように混ぜた後、50 mgずつ計40本の50mL遠沈管に分取した。32本には植種液（ニホンドロソコエビ飼育水由来の微生物）を、残りの8本にはろ過滅菌済み人工海水（微生物なしの対照系）を10 mLずつ入れ、ボルテックスした。また糞なしの対照系として、空の遠沈管2本に植種液10 mLのみを入れたものも準備した。遠沈管すべてに滅菌済みシリコ栓をつけ、バイオシェイカーで25 ℃, 60 rpm（水平振盪）で分解を行った。t = 0, 1, 2, 3, 6, 24, 48, 72 (hr)のタイミングで4本（＋微生物なし対照系１本、糞なし対照系はt=0, 72のみ）ずつ試験終了し、分析に供した。既報に従い種特異的プライマーを用いて定量PCRを行った。分解実験の結果より、上位捕食者の糞に含まれるニホンドロソコエビ由来DNAは、安定であり明確な減少傾向が認められないことが分かった。糞の顕微鏡観察では消化後の外骨格が多いことが示されたが、DNAそのものは残存しており、環境中でのDNA分析において捕食後の残渣（糞）が環境DNA起源になりうることが実験的に示された。なお、今回は既に実績のあるCTAB法でのDNA抽出を行っているが、今後DNA抽出手法の精査を行い、この分解動態がDNA抽出手法による制約が原因でないことを確認する必要がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度は、起源試料としてニホンドロソコエビを給餌したマハゼの糞を回収し、分解実験を実施した。当初は、より簡単と考えられる起源試料（当該生物自身由来の体細胞）から着手することを想定していたが、海産生物飼育に実績のある企業の協力が得られたため、より学術的新規性および実験操作上の難易度の高い起源試料（上位捕食者の糞）から取り組んだ。結果として、分解が非常に遅い（ほぼ分解しない）ことを明らかとすることができ、実環境中において、これらが環境DNAの起源になる可能性を実験的に示すことができた。DNAの抽出・検出手法が制約となっている可能性について慎重に検討が必要であるが、いずれにしても分解速度がそれほど大きくないことは間違いない。
以上のように、研究は順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
二年度目以降は、初年度の結果を確定するためにDNAの抽出・検出手法の最適化を進めたのち、他の起源試料（当該生物自身由来の体細胞）を用いたDNA分解実験を実施する。排泄起因の自己DNA排出については生物の代謝状態が影響すると考えられることから、当研究組織にて過去に実施した代謝物測定の技術も援用（分析機器の保守・調整を実施済み）しながら、生物の飼育条件にも着目して起源試料作製を行う。飼育用の機器も既に購入し、試運転を完了している。また、分解微生物にも着目し、実環境中の微生物群集と、今回の分解実験で用いている微生物群集（ニホンドロソコエビ飼育槽中の微生物）との差異についても情報を得る。以上のように、既に予備的検討に着手しており、実験遂行上の問題はない。
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