2019 Fiscal Year Annual Research Report
リン酸基結合分子の変化によるリン吸収端構造変化とそのクロマチン可視化応用
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19H04391
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
江島 丈雄 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (80261478)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大山 隆 早稲田大学, 教育・総合科学学術院, 教授 (60268513)
刀袮 重信 東京電機大学, 理工学研究科, 特別専任教授 (70211399)
東口 武史 宇都宮大学, 工学部, 教授 (80336289)
若山 俊隆 埼玉医科大学, 保健医療学部, 教授 (90438862)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 軟X線 / 誘導放出抑制 / シンチレーター / STED / 超解像 / 高空間分解能 / ナノ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度の主要な研究実績は走査型の２次元検出器の原理検証であった。開発する走査型２次元検出器は、試料を通過したⅩ線をシンチレーターに当て可視光に変換し、その蛍光領域を、誘導放出抑制（STED）により微小点に制限し、その点を走査することで実現する。300eVから1.3keVの軟X線領域において高い蛍光強度を示すシンチレーターとしてCe:LSOを選択し、軟X線励起による蛍光においてSTED現象を示すこと、ベクトル偏光ビームを用いたシンチレーターの蛍光領域を制限することが可能であることの２つの原理検証実験を行った。
この確認のために新たにレーザーダイオードを用いた光源、波長非依存性のベクトル偏光光学系、これらの光源、光学系およびシンチレーターを組み合わせた超解像顕微鏡の開発を行った。開発した顕微鏡をPhoton Factory施設の光学評価ビームラインBL11Dに持ち込み、その動作確認とCe:LSOの軟X線励起蛍光におけるSTED現象実験を行った結果、STED現象の確認とベクトル偏光ビームによる蛍光領域の制限が可能であることのどちらも明らかにすることができた。
また２次元検出器開発と並行して、リン酸基の吸収構造測定を行った。AMP、AAAおよびプラスミドDNAをリン酸基試料としてUVSOR BL4UのSTXMを用いてP-L2,3吸収実験を行った。得られたAMP、AAAのスペクトルを解釈するために分子軌道計算を行った結果、測定したスペクトル構造がリン酸基中のP3dを考慮した基底により再現することを見出した。これらの結果に基づきDNAについても同様の分子軌道計算による評価を行っているが、スペクトル中のピーク強度変化については再現できたものの、スペクトル構造についてはまだ途中であり、引き続き評価を行っていきたい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画に従って１９年度は、①リン酸基の吸収構造の測定と、②走査型２次元検出器の開発を行った。以下それぞれについて進捗状況をまとめる。
① DNA中に存在するアデノシンとリン酸基との分子結合状態を変えた物質としてAMP、AAAを選び、さらにプラスミドDNAを用いてリン酸基の電子状態を調べた。実験はUVSOR BL4UのSTXMを用いてP-L2,3吸収実験を行った。得られたAMP、AAAのスペクトルを解釈するために分子軌道計算を行った結果、測定したスペクトル構造を再現することに成功した。一方でDNAについても同様に分子軌道計算による評価を行っているが、スペクトル中のピーク強度変化については再現できたものの、スペクトル構造についてはまだ途中であり、引き続き評価を行っていきたい。
② 開発する走査型２次元検出器は、試料を通過したⅩ線をシンチレーターに当てて可視光に変換し、その蛍光領域を、誘導放出抑制（STED）により微小点に制限し、その点を走査することで実現する。19年度は軟X線励起蛍光におけるSTED法の原理検証実験を行った。開発した２次元検出器をPhoton Factory施設光学評価ビームラインBL11Dに持ち込み、対物レンズの空間分解能に基づくビームスポット径、蛍光領域径、ビームスポット強度と蛍光強度を測定した。このとき蛍光領域径δdは、ビームスポットδD、ビームスポット光強度I、蛍光領域径内の飽和蛍光強度Isを用いて、
δd/δD = √(1+I/I_S) (1)
と表される。実験結果より得られたδd/δDは式(1)によく従い、シンチレーターの軟X線蛍光においてSTED現象が確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画と同様に、①リン酸基の吸収構造の測定と、②走査型２次元検出器、③自己集合DNAとアポトーシス細胞の軟X線撮像に分けて述べる。
① 19年度に引き続き、分子軌道計算によるDNAにおけるリン酸基構造の解明を行う。
② STEDによる軟X線励起シンチレーターの蛍光領域制限の原理検証が終了したので、この結果を基に蛍光領域制限した微小スポットを走査し最終的に軟X線像を取得するための装置改良を行う。具体的には元装置にガルバノミラーの導入を微小スポットを走査する。操作が可能になった時点で装置を放射光施設に持ち込み、軟X線励起シンチレーター蛍光による軟X線像の取得を試みる。
③ ③の実験に関連する申請課題がUVSOR施設において採択されなかったため、③に関連する実験は②の装置開発のテスト実験として行う。具体的にはアポトーシスの段階１から２への進行は、DNA中のホスホジエステル結合（リン酸基を含む結合）を切断することによって起こる。DNAの位置は蛍光染色により確認でき、計画Ⅱで開発する２次元検出器を用いて蛍光像を確認した後、研究計画Ⅰで明らかにした吸収端構造に基づき軟X線像を測定し、ホスホジエステル結合切断前後の空間分布を得る。更に段階３の細胞において、変化した吸収端構造の強度が増加すれば断片化が進行したことを示し、新たな構造が観測されれば結合分子の状態が変化したことを示すと予想される。これらにより、アポトーシスの形状変化とリン酸基の周辺分子の変化の関係が明らかになる。
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