2020 Fiscal Year Annual Research Report
Investigation of the mechanism and prevention for ischemia-reperfusion injury by using blood-brain barrier-on-a-chip
| Project/Area Number |
19H04435
|
|---|
| Research Institution | Tohoku University |
|---|
Principal Investigator |
船本 健一 東北大学, 流体科学研究所, 准教授 (70451630)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
立川 正憲 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 教授 (00401810)
吉野 大輔 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80624816)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | マイクロ・ナノデバイス / 細胞・組織 / 生物・生体工学 / 流体工学 / ナノバイオ / 血液脳関門 / 微小血管網 / 虚血再灌流障害 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
前年度に引き続き、酸素分圧・力学的刺激・化学的刺激の3つの因子を同時制御できる3-in-1生体模擬チップ内に、灌流可能な微小血管網を形成する方法について検討を行った。微小血管網は、ヒトの血液脳関門（BBB）の機能を模擬するためヒトiPS細胞由来の血管内皮細胞とペリサイト、アストロサイトの3種類の細胞や、比較対象としてヒト臍帯静脈内皮細胞とヒト肺線維芽細胞の2種類の細胞をフィブリンゲルに混合してゲル流路内に配置し、1週間以上共存培養することで形成した。細胞播種後のゲル内の間質流が微小血管網の形成に与える影響に着目して検討を行うため、ゲル流路を挟むように配置する細胞培養液注入用の左右のメディア流路を分離したチップを新たに作製し、各メディア流路の出入口における細胞培養液の液面の高さを変えることでゲル流路の左右に圧力差を与え、ゲル内に間質流を発生させた。形成される微小血管網のサイズや分岐の数、ゲル流路内の微小血管網とメディア流路に形成する血管内皮細胞単層との接続の状態を評価した結果、脈管新生により形成される微小血管網には間質流の有無による差異は見られなかった。さらに、微小血管網周囲の酸素濃度を制御し、低酸素負荷（1時間または3時間）や酸素濃度の時間変化（10分毎に低酸素負荷と再酸素化の繰り返しを1時間または3時間）を作用させ、メディア流路に注入した蛍光標識デキストランが微小血管網からフィブリンゲルに透過して拡散する様子から物質透過率を計測した。物質透過率は低酸素負荷により増加する傾向があり、3時間後にはその差異がより顕著になることが明らかになった。低酸素負荷と再酸素化の繰り返しの条件に暴露した場合の物質透過率は、継続的な低酸素負荷の条件における値と同等の結果を示した。さらに、実験後に免疫蛍光染色による顕微鏡観察では、低酸素負荷時には低酸素誘導因子が核内移行していることが観察された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
独自の3-in-1生体模擬チップ内に3次元の微小血管網を形成し、周囲の酸素分圧の違いによる微小血管網の物質透過性の変化を定量評価したり、その際の細胞内のタンパク質の変化を観察したりする研究を実施しており、研究は順調に進行している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、3-in-1生体模擬チップ内に微小血管網を形成し、ヒトBBBの機能維持機構の解明に取り組む。チップ内のゲル流路に微小血管網を形成することが可能になったが、メディア流路上の血管内皮細胞の単層と接続し、細胞培養液を灌流させることができる微小血管網を形成できる確率は依然として低い。特に、微小血管網の物質透過性を評価する際、メディア流路に注入した蛍光標識デキストランがゲル流路のフィブリンゲル内に直接漏れ入って拡散していく場合があり、正確な物質透過率の妨げとなっている。そのため、メディア流路に形成する血管内皮細胞の単層と微小血管網との接続の促進については、引き続き解決すべき課題として取り組む。また、酸素分圧によるBBBの機能の変化を明らかにするため、微小血管網を形成したチップ内のガス流路に酸素濃度を調整した混合ガスを供給することで微小血管網の周囲の酸素分圧を制御し、虚血再灌流の発生を模擬する。この際、前年度までの実験結果を踏まえ、酸素分圧のレベルや低酸素負荷と再酸素化を模擬した時間変化のタイミング、それらの繰り返し回数を様々に設定して実験を繰り返す。また、虚血再灌流時の血流による力学的刺激（せん断応力や圧力）の影響についても加味するため、マイクロチューブポンプを接続して細胞培養液を灌流させた状況での実験も行う。それらの実験時の微小血管網の動態、各細胞の生存率、微小血管網の物質透過性を計測するとともに、免疫蛍光染色やウェスタンブロッティングを行って酸素分圧に応じたタンパク質の発現・局在・活性を評価する。得られた結果に基づいて、虚血再灌流障害に関与するシグナル伝達経路と障害の発症を防止するための標的分子について考察し、虚血再灌流発生時に血管内皮細胞の結合性を維持する目的で選定した化合物を細胞培養液に添加して実験を行い、BBBの機能を維持する方法を検討する。
|
Research Products
(3 results)
