2019 Fiscal Year Annual Research Report

興奮／抑制バランスを制御した培養神経回路によるてんかん発作発生機構の解明

Research Project

Project/Area Number	19H04437
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	神保泰彦東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 教授 (20372401)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	榛葉健太東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 助教 (80792655)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	脳神経 / 細胞・組織 / 神経工学
Outline of Annual Research Achievements	てんかん発作発生プロセスにおける“final common path”と考えられている神経回路の興奮／抑制（Excitatory/Inhibitory; EI）バランスに焦点を当て，EIバランスを人為的に制御した神経回路をin vitro系に構成してその特性を調べることを目指している．「EIバランスが乱れた形で一定の状態に達した神経回路」がてんかん発作発生の基盤となっている可能性があると考え，その状態を人為的に構成するのが本研究の立場である．終脳の発生過程において，脳室帯に存在する神経幹細胞が最初に背側で興奮性ニューロンに分化し，遅れて腹側で抑制性ニューロンが発生するとされ，この過程をソニック・ヘッジホッグ（Sonic HedgeHog; SHH）経路の活性化／不活性化により制御できることが示されている．本年度は，この手法をマウスiPS細胞に適用し，EIバランスの異なる大脳皮質培養神経回路を構成する条件の探索を実施した．マウスiPS細胞を利用して13日間の分化誘導操作を実施し，最終的に，以下の条件でEIバランスの制御が可能になるという結果を得た．興奮性細胞が優位な集団の形成には，SHH経路のアンタゴニストであるcyclopamineを5 uM の濃度で3日目から6日目まで添加，抑制性細胞が優位な集団の形成には，アゴニストであるSAGを，3日目から6日目に3 nM，6日目から8日目に10 nM，8日目から13日目に100 nMという条件で，さらに8日目から13日目には100 ng/mlのFGF8を添加した．得られた細胞集団を構成する興奮性／抑制性神経細胞の比率は免疫化学染色により定量評価を行ない，抑制性細胞の比率が大凡20-50 %の範囲の細胞集団が得られることを確認した．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 神経回路を構成する興奮性／抑制性神経細胞の割合を人為的に制御することによって，そのアクティビティのEIバランス依存性を調べ，てんかん発作が生じる機構に関する知見を得ることを目指している．第1段階として，EIバランスを人為的に制御した細胞集団の構成手法につき検討し，さらに免疫化学染色を利用した定量評価プロトコル確立を目指した．分化誘導プロセスにおける薬理操作（SHH経路に対するアゴニスト，アンタゴニストの投与）によりEIバランスの制御を試み，得られた培養神経回路の免疫染色画像についてbeta III tubulin （B3T）陽性細胞（神経細胞）を検出し，さらに4',6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）によって細胞体の位置を特定，その周囲直径13 umの範囲に含まれるグルタミン酸もしくはGABA陽性画素の輝度値を指標とする定量化を実施した結果，抑制性細胞の比率が大凡20-50 %の範囲の細胞集団が得られることが確認できた．異なるEI比率を有する2つの細胞集団を一定の割合で混合することにより，原理的には中間の比率を有する細胞集団が実現できることになる．大脳皮質における興奮性／抑制性神経細胞の割合は，動物種によらず7対3程度に維持されていることが知られており，その範囲外の比率で構成される培養神経回路が得られることになった．この系を利用して自発的に生じる神経回路のアクティビティを観測，さらに電気的・薬理的刺激によるてんかん発作様の活動の誘導と，その際に生じる神経回路／神経細胞／受容体・伝達物質レベルでの変化を調べるという進め方により，てんかん発作が生じるメカニズムに関する知見を得ることが期待できる．
Strategy for Future Research Activity	iPS細胞を利用してその分化誘導過程での薬理操作により，EIバランスを人為的に制御した培養神経回路を構成するにプロトコルを確立した．得られた培養神経回路の電気活動計測を実施し，自発的に生じる活動のEIバランス依存性，電気的／化学的刺激によるてんかん発作様活動の誘導とその際に生じる神経回路／神経細胞／受容体・伝達物質レベルでの変化を調べることが次のステップである．以下今後の進め方を具体的に記述する． 1. 自発的に生じる活動のEIバランス依存性 EIバランスを人為的に制御した細胞群を微小電極アレイ（MicroElectrode-Array; MEA）基板に播種して培養する．MEAは64個の透明電極をガラス基板上に集積化した細胞培養皿であり，長時間の計測が可能であること，基板上の電極を利用した慢性的な電気刺激が可能であることがその特徴である．大脳皮質培養神経回路は回路の広い範囲で同期したバースト活動を生じることが知られており，発生周期，個々のバーストの持続時間等を指標として，自発活動パターンのEIバランス依存性を調べる． 2. てんかん発作様活動の誘起とその基盤となる神経回路状態変化の解明第1段階として，GABAA受容体のアンタゴニストであるbicuculline投与に対するてんかん発作様活動の誘導を試みる．薬物投与に対する急性応答の記録は広く行われているが，てんかん発作発生の神経基盤解明を目指す立場から，強い活動が継続した状態に対する神経回路の適応，その結果として生じる変化について恒常的可塑性等の要素を勘案したという理解が重要と考えている．恒常的可塑性には，神経細胞単位から神経回路レベルにわたる，空間的／時間的に多様な制御機構が存在すると考えられており，時空間的な活動パターンに関する詳細な解析を実施してその特性を明らかにすることを目指す．