2020 Fiscal Year Annual Research Report
ヒト初代肝細胞をin vitroで増殖させ長期生存できる革新的培養システムの開発
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19H04439
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
興津 輝 東京大学, 生産技術研究所, 特任教授 (10378672)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ラット初代肝細胞 / 細胞培養システム / 細胞ファイバ技術 / コアシェルマイクロファイバ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
肝臓は生体の恒常性維持に寄与する重要臓器のひとつであり、その構成主要細胞である肝細胞を生体外で維持することは、医学分野での生理・病理の解明のみならず、医療/創薬分野における治療法/医薬品の開発にとって必須であると考えられている。しかしながら、生体より取り出した肝臓から分離した初代肝細胞は既存の一般的な培養方法ではその本来の機能を急速に失うため、多くの施設へ導入可能な新たな初代肝細胞の培養システムの構築が望まれている。本研究の目的は、細胞ファイバ技術を応用することによって、細胞分裂能と代謝・分泌能を維持したまま長期間にわたり初代肝細胞を培養することができるシステムを開発することである。細胞ファイバ技術とは、マイクロファイバ状の３次元組織を構築する技術である（Onoe H, Okitsu T, Takeuchi S, et. al. Nat Mater, 2013）。すなわち、マイクロ流体力学を応用してできる同軸２層流の内層に細胞と細胞外マトリックス（ECM）を配置し、外層にアルギン酸を配置する。その後アルギン酸をCa2+に暴露してゲル化させることで外殻（シェル）が形成され、直径約0.2mmのマイクロファイバ状の細胞封入体を作製できる。この細胞封入体を培養すると内核（コア）部分にファイバ状の３次元組織が構築される。以上の細胞ファイバ技術を用いたコアシェルマイクロファイバの作製とコア内への細胞の封入は、非常に単純な造りのデバイスによって可能となるため、他施設への普及は容易であると考えられる。研究実施計画の2年目の課題である、コアシェルマイクロファイバに封入したラット初代肝細胞の増殖・長期培養に成功し、かつ、in vitro・in vivoでの評価により肝細胞機能が維持されていることを確認した。なお、新型コロナウイルス感染症蔓延のため、実施には2020年から2022年までを要した
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、封入された初代肝細胞が細胞分裂能を発揮し、代謝・分泌能を長期間維持できる培養デバイスとして機能するよう、コアシェルマイクロファイバを開発する。品質均一化の観点から、引き続きラット由来の初代肝細胞を使用した。封入当日に自施設にて分離し、生存率85％以上のものを実験に用いた。研究実施2年目は、計画に沿って、まず、コアシェルマイクロファイバ内で、ラット初代肝細胞を増殖させ、代謝・分泌能を維持したまま長期間培養できることを検証した。具体的には、2.5x10^7cells/mlの条件でコアシェルマイクロファイバに封入されたラット初代肝細胞は、マウス線維芽細胞由来NIH/3T3のコンディションメディウムを培地に添加することで増殖し、30日間に渡り、肝細胞としての機能（アルブミン分泌能、尿素合成能、CYP活性）を維持したまま培養できることが判明した。続いて、コアシェルマイクロファイバに封入され増殖したラット初代肝細胞の創薬分野での応用可能性を検証した。具体的には、増殖したラット初代肝細胞を封入しているコアシェルマイクロファイバに、肝障害性薬剤（アセトアミノフェン、ジクロフェナク）を作用させ、50%阻害濃度（IC50）が培養30日目まで取得できること、それらIC50が既報値と類似していることが判明した。また、肝再生抑制効果を持つ化合物（レトロルシン）を作用させると、容量依存性に、ラット初代肝細胞のコアシェルマイクロファイバ内での細胞分裂が抑制されることが判明した。そして、コアシェルマイクロファイバに封入され増殖したラット初代肝細胞の移植医療分野での応用可能性を検証した。具体的には、2x10^7個ラット初代肝細胞をコアシェルマイクロファイバに封入したまま、無アルブミンラットの腸間膜内へ移植し、移植後35日間に渡り血液中アルブミン値の改善を認めた。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究実施2年目は、コアシェルマイクロファイバが、包含する初代肝細胞の分裂能と代謝・分泌能を維持できる培養デバイスとして機能することを、ラット初代肝細胞を用いて実証することができた。また、分裂増殖したラット初代肝細胞は、コアシェルマイクロファイバに封入された状態で、創薬分野・移植医療分野に応用できる可能性を有することを、in vitro・in vivoの実験系を用いて確認することができた。次年度では、計画に従い、初代肝細胞の由来をラットからヒトに変更して、コアシェルマイクロファイバの初代肝細胞用培養デバイスとしての開発を予定している。
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Research Products
(3 results)
