2019 Fiscal Year Annual Research Report
Study on a regeneration mechanism of corneal stroma in a decellularized scaffold and on the methods to construct corneal stromal like architecture
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19H04477
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| Research Institution | National Institute for Materials Science |
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Principal Investigator |
小林 尚俊 国立研究開発法人物質・材料研究機構, 国際ナノアーキテクトニクス研究拠点, 上席研究員 (90354266)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
橋本 良秀 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 助教 (40638384)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 脱細胞足場 / 角膜再生 / メカニズム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
実験計画書の段階で使用を予定していた脱細胞化角膜は、動物への埋入初期に不透明な状態で、透明化するのに2－3週間を要する弱点があり将来の臨床で問題が生じる恐れがあったため、これを改良する研究を並行してすすめてきた。今年度は、透明化する処理方法を概ね完成することができた。この改良型のサンプルに関して実験計画を見直し、再構築する作業を行った。このため、当初計画で初年度に予定していたモデル表面における相互作用の検討を次年度以降に回し、改良サンプルを持いた予備的な細胞培養試験、家兔を用いた材料の機能性、安全性の試験を開始した。
脱細胞化角膜の透明化処理・保存処理法の開発においては、各種多価水酸基を有する実質構造保護剤を用いて実験項に記載の条件で脱細胞処理を行った結果、低分子量薬の使用により透明性の向上が確認された。また、保存安定性を向上させるために、透明化処理を施した試料に関して各種糖の添加を併用して脱水し、その後凍結乾燥処理を行った。L929細胞を用いた毒性試験の結果、6か月後のサンプルでも、洗浄処理を十分に行えば、細胞毒性はほとんど認められず改良前の足場と同等の安全性が確保されている結果となった。このサンプル上に、角膜上皮細胞を播種して静置培養を行い、上皮細胞の生着性と増殖性を確認した結果、細胞の生着と増殖が確認された。また、家兔角膜内ポケットへの改良した脱細胞サンプルの埋入試験を開始し、In vivoにおける安全性の確認作業も開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画の大幅な変更はあったが、旧脱細胞角膜足場より優れた改良型脱細胞角膜足場材料の開発が進み、新規性の高い成果が得られている。
開発された処理法は以下の通りである。東京芝浦臓器株式会社より購入した成体ブタ眼球から強角膜を採取した。採取した強角膜を10%グリセロール含有培地に浸漬し、冷間等方加圧装置（Dr. CHEF）を用い、10 ℃にて600MPaの高静水圧印加処理を10分間行った。その後、3.5 % w/v デキストラン、0.2 mg/ml DNaseⅠ、0.01 mg/ml ゲンタマイシンを含む培地による振盪洗浄を48時間行い、細胞残渣を除去した。さらに脱細胞化角膜を50wt％スクロース溶液に浸漬後、凍結乾燥することによりガラス化した脱細胞化角膜を得た。得られた脱細胞化角膜は実験に使用するまで4℃にて保存した。この方法で得られたサンプルは、旧処理法で得られる不透明な脱細胞角膜足場と比較すると可視光の透過性が格段に向上した材料となっている。しかし、物性的な機能向上が認められるだけでは実用性が確保されないので、安全性を担保するための試験を前倒しで開始した。保存性を向上させたサンプルに関して、予備的な毒性試験をL929細胞を用いて行った結果、保存処理剤除去処理が不十分な場合には細胞の増殖に影響が出る可能性が示されたが、十分な除去処理を行うことで細胞毒性は認められなくなることが確認され、更に、角膜上皮細胞を用いた静置培養実験において、上皮の生着と増殖が確認され、次年度以降に予定しているメカニズム解析への目途が立った。また、改良した脱細胞角膜足場のIn vivoにおける安全性を検証するため、家兔角膜ポケット法を用いた埋入試験を開始した。また、来年度から開始する予定の細胞を用いた再生メカニズムの解析に向けた、モデル実験系を構築するためのサンプル形態の最適化、装置準備などを開始した。
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| Strategy for Future Research Activity |
脱細胞化角膜の実用化に向けたA-MED 橋渡し研究シーズAなどの採択を受けて、本研究で行う基礎研究とA-MED実用化研究をシームレスに、且つ、双方の研究から得られる知見を総合的に用いることにより、基礎、応用共に成果創出を加速する方法をとる。
新規処理法により得られる改良した脱細胞化角膜足場材料を用いて、当初計画の初年度に行う予定であった、材料‐タンパク相互作用の解析などを進める。また、再生メカニズムをIn vitroで解析するための還流培養系での実質細胞、上皮細胞の共培養液を構築するとともに、上皮層の再生過程を検証するための脱細胞足場上でのスクラッチ試験法などの構築を行う予定である。さらに、今年度判明した保存剤の残存による細胞への影響をより詳細に検討するとともに、家兔角膜ポケットから得られる埋入組織の組織学的検討を進め、メカニズム解析に対するベースデータとして研究を進める予定である。
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