Development of on-chip liquid biopsy for achieving express diagnosis of cancer primary tumor

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H04489
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 中島 雄太 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 准教授 (70574341)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤原 章雄 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 講師 (70452886)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: がん検出 / リキッドバイオプシー / バイオマイクロデバイス / バイオセンサ / QCM

Outline of Annual Research Achievements

本年度当初は、昨年度から継続して、各部位のがん環境にさらされた細胞が産生するサイトカインや発現するたんぱく質、細胞形態を明らかにための実験を行った。具体的には、細胞が産生するサイトカインや発現するたんぱく質などを評価した。肺がん、食道がん、乳がん、卵巣がんの各種がん細胞の培養上清を回収し、回収した上清を細胞の培養液に添加することによって、細胞を疑似的にがん環境中で培養した。この培養センシング用細胞の観察やELISAでの上清評価、ウェスタンブロッティングでの評価を行った結果、がん種に応じて産生されるサイトカインが異なることを明らかにし、がんの原発巣を特定するための基礎データを得た。本成果は本研究を推進する上で重要な知見である。
また、センシング用細胞の培養デバイスの検証を行った。デバイスはフォトリソグラフィを主とするマイクロマシニング技術を駆使して微小構造体を持つモールドを製作し、そのモールドにシリコーン樹脂（PDMS）を流し込んでキャスティングすることにより製作した。構築したデバイス内でセンシング用の細胞を培養できることを実証した。構築したデバイス内での細胞の分布に偏りがあるため、次年度はこの課題を解消することを目指す。さらに、水晶振動子マイクロバランス（QCM）を用いることにより、細胞の産生物質をリアルタイムで検出・評価するための基礎実験を行った。具体的にはQCMの電極上に抗体を修飾し、そこにリコンビナントの抗原を送液することによってリアルタイム検出が可能であることを実証した。この際、リコンビナント抗原の濃度を調整し検出範囲を評価した。次年度も引き続き検出範囲・感度を明らかにする検証を進める。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通り、複数種類の部位のがん細胞からのシグナルを基にし、センサ細胞から産生されるサイトカインや発現するたんぱく質、細胞形態の評価を行い、産生物の違いを明らかにした。また、検出用細胞培養デバイスの構築も行い、センシング用細胞をデバイス内で培養できることを示した。さらに、QCMを用いてリコンビナント抗原の検出を確認できたため、センシング用細胞が産生した産生物を検出できることを示唆した。上記の通り当初の計画を着実に実行しており、次年度も計画に沿った研究推進が可能であることから、今年度の達成度はおおむね順調であると言える。

Strategy for Future Research Activity

次年度は、QCMを用いることにより、細胞の産生物質をリアルタイムで検出・評価するための検証実験を行う。昨年度までに、QCMの電極上に抗体を修飾し、そこにリコンビナントの抗原を送液することによってリアルタイム検出が可能であることを実証した。この際、検出対象のターゲット物質のみではシグナルが小さく、感度を向上する必要があることが示唆されたため、磁性粒子などを用いたシグナル増幅を行う。この増幅方法や検出条件を検証し目的の実現をめざす。さらにリコンビナントの抗原の濃度条件を複数設定することにより検出範囲や限界を明らかにする。これと同時に、ELISAでの検証も行い、リアルタイムでの測定結果とELISAでの測定結果に相関関係があることを実証する。
また、センシング用細胞の培養デバイスについては、PDMS構造体での製作が完成し、デバイス内での細胞培養に成功した。一方で、細胞の密度や分布に改善が必要であることが明らかになったため、デバイスへの表面処理や構造の最適化などを行うことによりデバイスの改善を行う。最終的には、細胞培養デバイスと検出部分を統合することにより、リアルタイムで検出・評価可能なデバイスを実現する。