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2020 Fiscal Year Annual Research Report

Dynamic femtoliter reactor technology for next generation digital bioassays

Research Project

Project/Area Number 19H05624
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

野地 博行  東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 教授 (00343111)

Project Period (FY) 2019-06-26 – 2024-03-31
Keywords1分子計測 / デジタルバイオ分析 / フェムトリアクタ / ナノバイオ / インフルエンザ
Outline of Annual Research Achievements

本プロジェクトは、これまでの「静的」なリアクタ技術 から「動的」なリアクタ技術へと基盤技術を一新することを目的としている。研究項目の柱は、項目1「動的fLリアクタデバイスの基盤技術開発」、項目2「on- chip統合型デジタルバイオ分析法の確立」、項目3「分子個性の多次元解析と個性発現メカニズムの解明」である。
項目1ではPEG/DEX相分離とfLリアクタを融合させタンパク質やDNA濃縮システムを構築した。またfLリアクタからドロプレット回収技術としてIRレーザーを用いてドロップレットが個別回収できることを見出した。またPEG修飾したリアクタデバイスから指でタッピングするだけでドロップレット(0.5-5.0μm)を一括回収できることを見出した。このドロップレットを鋳型とした均一系リポソームを作成することにも成功した。項目2では、ナノ粒子を用いた手法及びsplit型 酵素を用いた手法を検討している。特に2019年度に開発したナノ粒子計測技術を発展させ、異なるナノ粒子を用いたmultiplex型のdigital ELISA法を確立した。この方法はある共同研究先である民間企業へ引き継がれている。また当初計画になかった新型コロナウイルスの超高感度検出系の開発に取り組んでいる。項目3では、ウイルスの「個性」を触媒活性のばらつきの計測に取り組んだ。特に、インフルエンザウイルスの酵素活性、阻害剤に対する耐性を粒子ごとに計測することに成功し、kcatおよび50%阻害濃度(IC50)が粒子毎に30%程度以上異なることを見出した。 また2種類の阻害剤に対するIC50に相関がなかったことから粒子の酵素機構は異なることが示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

本プロジェクトの柱は、項目1「動的fLリアクタデバイスの基盤技術開発」、項目2「on-chip統合型デジタルバイオ分析法の確立」、項目3「分子個性の多次元解析と個性発現メカニズムの解明」の三本である。項目1では高分子混合溶液による相分離を検討しDEX ドロプレットに DNA やタンパク質を数十倍以上 に濃縮するリアクタ技術の開発に成功した。またIR照射による局所加熱によって相分離が誘発される新現象を発見した。項目2では異なるナノ粒子を用いて複数のターゲット分子を1分子計測できるmultiplex型デジタルバイオ分析の新手法の確立に成功した(Lab Chip 2020)。さらに当初計画にはなかった新型コロナウイルス検出にも取り組んでおり、短時間での超高感度検出が見込まれる。項目3では、インフルエンザウイルスの粒子個性の定量計測に成功している。インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ活性の速度論的パラメータおよび2種類の阻害剤に対する50%阻害濃度(IC50)を測定し、粒子ごとに酵素活性、IC50にばらつきがあること、2種の阻害剤のIC50に相関が見られないことからそれぞれの阻害剤に対する耐性機構が異なることが示唆された。 (Anal Chem 2021)。これは、ウイルスが薬剤耐性をどのように獲得するのかを見る上で極めて重要な知見を与える基盤となると考える。
以上の通り、全て研究項目で着実な成果が得られており、総じて良好であると判断する。

Strategy for Future Research Activity

項目1「動的fLリアクタデバイスの基盤技術開発」は、i) 分子濃縮、ii) 連続溶液交換、iii) リアクタ回収技術を軸として開発を行っている。i) については、DEX/PEG相分離と統合したfLリアクタ技術の特性解析を進め、この技術を確立させる。また、局所加熱により相分離が誘起される現象の成立条件を詳細に解析し、fLリアクタの制御技術として確立することを目指す。ii) インフルエンザの多次元デジタル計測で連続溶液交換技術は確立した。今後は、独自の無細胞遺伝子発現能を有するfLリアクタ(人工細胞リアクタ)技術と統合することで、新しい酵素スクリーニング法・DNA連結・合成・スクリーニング技術を開発する。iii) 上述の人工細胞リアクタを用いたスクリーニングでは、狙ったfLリアクタからDNA回収技術が必要となる。局所加熱技術を用いて、光学操作によるDNA回収技術を確立することで、スクリーニング技術を高効率化させる。
項目2「on-chip統合型デジタルバイオ分析法の確立」は、新型コロナウイルスを含むRNAウイルスの迅速超高感度検出を可能とする新規のデジタルバイオ分析法の確立を目指す。ターゲットRNAによって酵素活性を活性化させる系を構築し、迅速にウイルスRNAを特異的に検出するデジタルバイオ分析法の確立を目指す。
項目3「分子個性の多次元解析と個性発現メカニズムの解明」では、インフルエンザウイルスの多次元デジタル計測に成功した。今後は、fLリアクタからのRNAゲノム回収技術と組み合わせることで、ノイラミニダーゼ活性および阻害剤耐性とゲノム配列との相関を明らかにし、その粒子の活性の多様性が出現するメカニズムを解明する。一方、ウイルスの構造多型が機能の多様性の基盤となっている可能性も検討するため、クライオ電子顕微鏡による解析と組み合わせた解析も検討する。

  • Research Products

    (22 results)

All 2021 2020

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results,  Open Access: 1 results) Presentation (18 results) (of which Invited: 6 results)

  • [Journal Article] Multidimensional Digital Bioassay Platform Based on an Air-Sealed Femtoliter Reactor Array Device2021

    • Author(s)
      Shingo Honda, Yoshihiro Minagawa, Hiroyuki Noji, Kazuhito V Tabata
    • Journal Title

      Analytical Chemistry

      Volume: 93 Pages: 5494~5502

    • DOI

      10.1021/acs.analchem.0c05360

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Multiplexed homogeneous digital immunoassay based on single-particle motion analysis2020

    • Author(s)
      Kenji Akama, Hiroyuki Noji
    • Journal Title

      Lab on a Chip

      Volume: 20 Pages: 2113~2121

    • DOI

      10.1039/d0lc00079e

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Multiplexed single-molecule enzyme activity analysis for counting disease-related proteins in biological samples2020

    • Author(s)
      Shingo Sakamoto, Toru Komatsu, Rikiya Watanabe, Yi Zhang, Taiki Inoue, Mitsuyasu Kawaguchi, Hidehiko Nakagawa, Takaaki Ueno, Takuji Okusaka, Kazufumi Honda, Hiroyuki Noji, Yasuteru Urano
    • Journal Title

      Science Advances

      Volume: 6 Pages: eaay0888

    • DOI

      10.1126/sciadv.aay0888

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Monodisperse Liposomes with Femtoliter Volume Enable Quantitative Digital Bioassays of Membrane Transporters and Cell-Free Gene Expression2020

    • Author(s)
      N. Soga, A. Ota, K. Nakajima, R. Watanabe, H. Ueno, and H. Noji
    • Journal Title

      ACS Nano

      Volume: 14 Pages: 11700-11711

    • DOI

      10.1021/acsnano.0c04354

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Autonomous artificial cell reactor technology2021

    • Author(s)
      野地博行
    • Organizer
      東京大学SNU-UTJoinworkshop
    • Invited
  • [Presentation] デジタルバイオ分析法2020

    • Author(s)
      野地博行
    • Organizer
      中谷賞大賞受賞講演
  • [Presentation] デジタルバイオ分析法によるオンサイト検出の可能性と課題2020

    • Author(s)
      野地博行
    • Organizer
      科学技術振興機構CRDSワークショップ
  • [Presentation] デジタルバイオ分析法とその先2020

    • Author(s)
      野地博行
    • Organizer
      日本生物物理学会総会シンポジウム
    • Invited
  • [Presentation] デジタルバイオ分析と人工細胞創生2020

    • Author(s)
      野地博行
    • Organizer
      立教大学理学部生物学科セミナー
    • Invited
  • [Presentation] バイオの未 来?協奏力と妄想力でしょ!2020

    • Author(s)
      野地博行
    • Organizer
      日本化学会 CSJ Chemistry Festa フェスタ第 10 回記念企画
    • Invited
  • [Presentation] Autonomous artificial cell reactor technology2020

    • Author(s)
      野地博行
    • Organizer
      JST 日英合成生物学ワークショップ
    • Invited
  • [Presentation] デジタルバイオイノベ ーション2020

    • Author(s)
      野地博行
    • Organizer
      東京大学臨床生命医光学連携機構シンポジウム
    • Invited
  • [Presentation] Development of a self-reproducing vesicular system driven by internal phospholipid synthesis2020

    • Author(s)
      中嶌 康太
    • Organizer
      第58回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] Multi-Dimensional (MD) Digital Bioassay unveils heterogeneous drug-susceptibility of influenza A virus in a single-virus resolution2020

    • Author(s)
      本田 信吾
    • Organizer
      第58回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] Stabilization of micro phase-separated droplet and examination of new artificial cell system2020

    • Author(s)
      藪田 萌
    • Organizer
      第58回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] Multiphase droplet formed by liquid-liquid phase separation2020

    • Author(s)
      友原 貫志
    • Organizer
      第58回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] Development of an enzyme-coupled fluorometric digital bioassay for ATPase2020

    • Author(s)
      上野 博史
    • Organizer
      第58回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] Characterization of the enzymatic property and structural dynamics of the T3SS ATPase from Enteropathogenic Escherichia coli2020

    • Author(s)
      鈴木 綾
    • Organizer
      第58回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] Development of a split enzyme for wash-free digital bioassay2020

    • Author(s)
      馬 彦博
    • Organizer
      第58回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] 一つひとつの生体分子・粒子の活性を多条件下で測定可能なデジタルバイオ計測技術の開発2020

    • Author(s)
      本田 信吾
    • Organizer
      第10回 CSJ化学フェスタ2020
  • [Presentation] 人工膜小胞内リン脂質合成による自律的細胞分裂機構の構築2020

    • Author(s)
      中嶌康太
    • Organizer
      第10回 CSJ化学フェスタ2020
  • [Presentation] Wash-freeデジタルバイオ計測のためのsplit酵素の開発2020

    • Author(s)
      馬 彦博
    • Organizer
      第10回 CSJ化学フェスタ2020

URL: 

Published: 2023-12-25  

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