2021 Fiscal Year Annual Research Report
Dynamic femtoliter reactor technology for next generation digital bioassays
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19H05624
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
野地 博行 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 教授 (00343111)
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| Project Period (FY) |
2019-06-26 – 2024-03-31
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| Keywords | 1分子計測 / デジタルバイオ分析 / フェムトリアクタ / ナノバイオ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、フェムトリットルサイズの超微小溶液リアクタアレイ技術(fLリアクタ技術)を開発し、これを利用した1分子デジタルバイオ分析分野を牽引してきた。 しかし、これまでのfLリアクタは受動的に溶液を収納するだけであり、その応用範囲には制限があった。本プロジェクトは、これまでの「静的」なリアクタ技術 から「動的」なリアクタ技術へと基盤技術を一新することを目的としている。研究項目の柱は、項目1「動的fLリアクタデバイスの基盤技術開発」、項目2「on- chip統合型デジタルバイオ分析法の確立」、項目3「分子個性の多次元解析と個性発現メカニズムの解明」である。
項目1ではpolyethylene glycol (PEG)/dextran (DEX)高分子溶液による相分離を検討して、DEXドロップレットにタンパク質を濃縮するタグシステムを開発した。またIRレーザーを用いた局所相分離技術を応用し、DNA濃縮を時空間的に制御する技術を開発した。項目2では、遺伝子連結・増幅と統合した遺伝子発現系の開発に着手している。数分子のDNAフラグメントを起点とする一連の反応（DNA連結→増幅→遺伝子発現）に関する予備的結果が得られている。また、遺伝子発現機能をon-chip上で5倍以上も向上することに成功した。項目3では、酵素分子の個性のばらつきと、酵素分子の基質特異性の柔軟性に関する相関を見出すことに成功した。これは、酵素分子が進化の過程で新しい触媒反応能をどのように獲得してきたのかに対して、「分子間個性すなわち機能多型が、新規反応獲得の分子基盤である」という仮説を導き出すものであり、生体分子の進化理論に重要な知見を与える発見である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本プロジェクトの柱は、項目1「動的fLリアクタデバイスの基盤技術開発」、項目2「on-chip統合型デジタルバイオ分析法の確立」、項目3「分子個性の多次元解析と個性発現メカニズムの解明」の三本である。項目1では高分子混合溶液による相分離を検討しDEX ドロプレットに生体分子を濃縮する条件検討を行った。その結果、安定してDEXドロップレットにタンパク質を濃縮するタグシステムの開発に成功した。これらの技術は現在特許出願に向けて準備中である。加えて、IR照射による局所相分離技術を応用することで、DNA濃縮を時空間的に制御する技術の開発にも成功した。項目2では、遺伝子発現機能を再構成させた人工細胞リアクタの遺伝子発現のノイズ解析に成功し、反応の確立性に起因するintrinsic noiseとリアクタ毎の活性の違いに起因するextrinsic noiseがほぼ同等にノイズ源となることが示された。この知見に基づき、遺伝子連結・増幅と統合した遺伝子発現系の開発に着手した。すでに、数分子のDNAフラグメントを起点とする一連の反応（DNA連結→増幅→遺伝子発現）に関する予備的結果が得られている。加えて、遺伝子発現機能をon-chip上で5倍以上も向上することに成功した。これは、当初計画にはなかった想定外の成果である。項目3では、酵素分子の個性のばらつきと、酵素分子の基質特異性の柔軟性に関する相関を見出すことに成功した。これは、酵素分子が進化の過程で新しい触媒反応能をどのように獲得してきたのかに対して、「構造多型に伴う機能多型が、新規反応獲得の分子基盤である」という仮説を導き出すものであり、生体分子の進化理論に重要な知見を与える発見である。
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| Strategy for Future Research Activity |
項目1「動的fLリアクタデバイスの基盤技術開発」では2021年度までに「分子濃縮技術」および「連続溶液交換技術」の確立に成功した。2022年度は、まず「リアクタ回収技術」を確立する。これによって、さまざまな条件で精度よく酵素ライブラリを評価するスクリーニング技術を確立させる。加えて、これまでのデジタルバイオ計測技術を革新する新手法の開発にも着手する。具体的には、これまでのデジタルバイオ計測で必要としてきたoil封入プロセスやマイクロデバイスを必要としない第二世代デジタルバイオ計測技術の要素技術に着手する。項目2「on-chip統合型デジタルバイオ分析法の確立」では、DNAフラグメントを反応起点とした「DNAフラグメント連結→増幅→遺伝子発現」を効果的に統合したシステムの開発に挑む。これによって、オリゴDNA合成以外のプロセスを無細胞オンチップ化した「オンチップ無細胞システム」の基盤が確立され、多種類のタンパク質分子を超高速にプロトタイピングする技術への道が開ける。項目3「分子個性の多次元解析と個性発現メカニズムの解明」では、昨年度発見された「分子個性と新機能獲得能力」に関する正の相関について、さらに解析を進め、タンパク質進化理論の刷新を目指す。
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