2020 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular basis of bulk transport machinery playing key roles in lipid secretion in plant cells
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19H05638
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
矢崎 一史 京都大学, 生存圏研究所, 教授 (00191099)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
粟野 達也 京都大学, 農学研究科, 助教 (40324660)
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| Project Period (FY) |
2019-06-26 – 2024-03-31
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| Keywords | 脂質分泌 / 植物細胞 / バルク輸送 / ABCトランスポータ / 膜ダイナミクス / シコニン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生理活性の高い数多くの二次代謝産物を特定の細胞から細胞外に分泌し、アポプラスト（細胞外スペース）に蓄積する。しかし、水に溶けない物質を含有した脂質一重膜の油滴が、どのようなメカニズムで水を主とするサイトゾルを細胞膜に向けて移動し、細胞を殺すことなく分泌されうるのか、その分子メカニズムは依然として未知のままである。本研究でモデル実験系として用いるムラサキの培養細胞は、重量あたり10%を超える脂溶性物質のシコニン誘導体を細胞外に分泌する。この系を用いて、植物細胞からの脂質のバルク輸送を司る輸送マシナリーの構成メンバーの同定と、輸送メカニズムの分子機構を明らかにすることを目的とする。
本年度は、これまでに行ったウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（VIGS）の成果、および高効率の安定形質転換系の確立などを論文としてまとめ公表すると共に、毛状根を用いた系で、ゲノム編集にて複数の遺伝子のノックアウト実験を開始した。また最近、ムラサキのゲノム配列が公開されたことを受けて、研究室内でもムラサキのゲノムを独自にアセンブルし、遺伝子の検索をできるようにした。その結果、ノックアウトの対象とする遺伝子のコピー数や、類似遺伝子の配列などを以前より詳細に比較することができるようになった。これはガイドRNAのデザインをする上で非常に役立つリソースとなった。これまでに、絞り込んだ８遺伝子に関しては、GFPタグと HA タグを用いた融合タンパク質とし、互いのタンパク質間相互作用を免疫沈降法によって解析した。
電子顕微鏡解析においては、通常の化学固定法では脂溶性の高いシコニンが流出するという問題を解決するため、新たな固定法を考案し、細胞内のシコニンも高電子密度でその局在が可視化されるプロトコールを確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、研究計画としてA) - F) の６項目の実験項目を立てている。
A) 膜ダイナミクスに関わるメンバーの絞り込み：マルチオミックスを利用して、脂質分泌に関わると考えられる遺伝子を８種に絞り込んだ。B) ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング (VIGS) による機能解明：リンゴ小球形潜在ウイルス を利用したベクター系で、モデル遺伝子として内在性のPDS遺伝子をサイレンシングができることを示した。成果は論文として発表した。
C) 毛状根形質転換系を用いた遺伝子機能解析：国産のA13株を用いて、50 - 70% の効率で遺伝子導入をできる実験系ができた。現在、ムラサキで複数の遺伝子をターゲットにゲノム編集を始めている。D) 脂質分泌時における膜のダイナミクスの解明：シコニンの分泌に関するLTPファミリー分子 LeDI2が小胞体局在のタンパクであることを示した。
E) タンパク質ータンパク質相互作用の解析：上記の８遺伝子をGFP と HA タグを用いた融合タンパク質とし、これを N. benthamiana で発現させて、免疫沈降による相互作用解析を行なった。これまで上記LeDI-2とシコニン生合成の鍵酵素LePGTが相互作用することを見出した。F) 高圧凍結置換固定法を用いた脂質輸送に関わる細胞内小器官の電顕解析：通常の化学固定法では、シコニンは脂溶性が高く著しく流出してしまう問題があった。これを解決するために新しい固定法を考案し、細胞小器官がそれぞれ異なった電子密度で観察され、細胞内のシコニンも高電子密度でその局在が可視化されるプロトコールを確立した。
現在の問題点として、ALSVによるVIGS系は実施者の感覚による部分が大きく、感染効率が著しく低くなることがある。また、ABCトランスポータではベクター構築時に変異が頻繁に入るという問題が生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
VIGS系は、遺伝子の機能を短時間でスクリーニングするのに向いているため、現在人的ファクターによる感染効率低下に対して対策を講じ、引き続き各候補遺伝子８種類の遺伝子配列を用いて、ムラサキ植物体の各候補遺伝子の一過的ノックダウン・クローンを作成し、シコニン生産とシコニン分泌に対する影響を評価する。感染作業が実施者の感覚による部分が大きく、実施者が変わったことで感染効率が著しく低くなっているため、対策としては、ウイルスの接種方をカーボランダムからパーティクルボンバードメントに変更する、あるいはウイルスを濃縮・精製することを検討する。
上記と並行して候補遺伝子８種に関して、ゲノム配列よりコピー数が多いものについては、誘導性のプロモータによるRNAiコンストラクトによるノックダウン、コピー数の少ないものについては、ゲノム編集によるノックアウトラインを作成する。作成できたクローンに関しては、分担者（粟野博士）に送り、電子顕微鏡解析を推進する。一方、「輸送カーゴ」の機能が支障を受けた場合に、代謝産物としてどの状態、あるいはどのシコニン中間体の形で細胞内にとどまるのかを、高分解能LC-MSを用いて定量分析する。
タンパク質同士の相互作用解析データを補強するため、必要に応じてBiFCや酵母twoハイブリッド(Y2H)システムなど、他の手法は試みる。
もう一つの問題として、候補遺伝子の１つLeABCG1 のloss-of-function 用ベクターのクローニングで行き詰まっている点が挙げられる。これはABCトランスポータで時々みられるが、大腸菌内で変異が多く入ることが原因である。この解決には、ホスト株を変更する、あるいは大腸菌を全く用いないコンストラクト作成手法を適用することで対応する。
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Research Products
(11 results)
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[Journal Article] Parallel evolution of UbiA superfamily proteins into aromatic O-prenyltransferases in plants2021
Author(s)
2. Munakata, R., Olry, A., Takemura, T., Tatsumi, K., Ichino, T., Villard, C., Kageyama, J., Kurata, T., Nakayasu, M., Jacob, F., Koeduka, T., Yamamoto, H., Moriyoshi, E., Matsukawa, T., Grosjean, J., Krieger, C., Sugiyama, A., Mizutani, M., Bourgaud, F., Hehn, A., Yazaki, K.
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Journal Title
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Volume: 118
Pages: e2022294118
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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