2021 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular basis of bulk transport machinery playing key roles in lipid secretion in plant cells
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19H05638
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
矢崎 一史 京都大学, 生存圏研究所, 教授 (00191099)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
粟野 達也 京都大学, 農学研究科, 助教 (40324660)
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| Project Period (FY) |
2019-06-26 – 2024-03-31
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| Keywords | 植物細胞 / 脂質分泌 / バルク輸送 / ABCトランスポータ / 膜ダイナミクス / シコニン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物は生理活性の高い数多くの二次代謝産物を特定の細胞から細胞外に分泌し、アポプラスト（細胞外スペース）に蓄積する。しかし、水に溶けない物質を含有した脂質一重膜の油滴が、どのようなメカニズムで水を主とするサイトゾルを細胞膜に向けて移動し、細胞を殺すことなく分泌されうるのか、その分子メカニズムは依然として未知のままである。本研究でモデル実験系として用いるムラサキの培養細胞は、重量あたり10%を超える脂溶性物質のシコニン誘導体を細胞外に分泌する。この系を用いて、植物細胞からの脂質のバルク輸送を司る輸送マシナリーの構成メンバーの同定と、輸送メカニズムの分子機構を明らかにすることを目的とする。
本年度は、電子顕微鏡解析において、従前の化学固定法では脂溶性の高いシコニンが流出する、脂質をハイコントラストで再現性よく観察することができない、といった問題点を解決する改良型の化学固定法に関して論文としてMicroscopy 誌に公表した。また、脂溶性物質の分泌に関することが示唆されたABCタンパク質と膜交通との相互作用の可能性について、網羅的な論文データの解析を行い、Current Opinion in Plant Biology に発表した。
この他、ムラサキのゲノム配列が報告されたことを受け、大規模トランスクリプトームデータをシステマティックに精査し、従前より解析対象としてきた遺伝子８個に加え、新たにフルサイズのABC輸送体を候補として追加した。また、VIGS系の抱える問題点を解決するため、シロイヌナズナとタバコを用いて各候補遺伝子の安定形質転換体を多数作成し、それぞれの植物の内在性代謝産物の分泌効率を解析することで、物質輸送に対する各遺伝子産物の寄与を評価した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
A) 膜ダイナミクスに関わるメンバーは、絞り込みを修了している８遺伝子に加え、ムラサキの大規模トランスクリプトームとゲノム情報を精査し、新たにフルサイズのABC輸送体を候補として追加した。B) VIGS系は、遺伝子機能の迅速スクリーニングに向いているが、感染効率が実施者の感覚によるところが大きく技術的な改善が難しかった。そのため、シロイヌナズナとタバコを用いた安定形質転換体を多数作成し、各遺伝子の単独の高発現による内在性物質の細胞外分泌を評価することとした。その結果、全ての遺伝子でジテルペン系代謝産物の分泌抑制が認められた反面、各ホスト植物の二次代謝産物の分泌を促進する遺伝子が複数認められた。
C) 高効率でムラサキに遺伝子導入可能なRhizobium rhizogenes（旧名Agrobacterium rhizogenes）A13株は、導入したベクターを高頻度で脱落させてしまうことが新たに判明し、研究推進に遅滞が生じた。現在は、ATCC15834株に置き換えて研究を行っている。D) シコニン生産と正に相関するLTP様タンパク質のLeDI-2について、R3年度では、保存されている８つのCysに点変異を導入し、小胞体(ER) ネットワークにおける局在パターンに影響を与えることを突き止めた。
E) 候補遺伝子８個とLeDI2遺伝子に加え、生合成系を内膜にアンカーするゲラニル基転移酵素LePGTについて、タグを利用した免疫沈降でLeDI2とLePGTが相互作用をすることを認めていたが、さらにR3年度にはBiFC を使ってもこの結果が確認され、両タンパク質がER上で相互作用することを明らかにした。F) 脂質を含む油滴構造を観察する新しい化学固定法が確立できたことで、本手法をムラサキ毛状根にも適用し、根端付近のシコニン生産性表皮細胞と非生産性の皮層細胞の観察手法の条件検討を行なった。
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| Strategy for Future Research Activity |
ムラサキへの遺伝子導入に関しては、ATCC15834株を使うことでベクターの抜け落ちを防ぐことができることが判明したので、今後はこの株を用いて研究を進める。ただし本菌株は大臣承認実験の対象であることから、電顕観察のためには当研究室でまず毛状根を化学固定にて殺し、菌の残存がないことを確認した後、電顕観察に持っていく。
候補遺伝子のloss-of-functionの実験を進める。ゲノム配列が報告されたことに加え、最近の当研究室の成果から、ムラサキでゲノム編集がうまく機能することが明らかとなったので、今後はRNAiコンストラクトを用いる、あるいはゲノム編集用のベクターを用いることで、候補遺伝子のloss-of-function の実験が推進できるものと見込まれる。特に、フルサイズのLeABCGに関しては、大腸菌に入れることで多くの変異が入ってしまうことから、短鎖のgRNA を利用するゲノム編集が適していると判断される。作成したムラサキ毛状根のゲノム編集ラインを使い、LC-MSで脂溶性物質の細胞外分泌を評価する。前述の新規化学固定法で使用したマラカイトグリーン、イミダゾール、p-フェニレンジアミン等の固定剤を凍結置換固定法に応用し、細胞内膜系の構造をよりインタクトかつ高コントラストで観察する手法を確立する。ムラサキ毛状根表皮細胞における脂質の細胞内輸送、細胞外への分泌と、細胞内膜系との関連に注目して電子顕微鏡解析を進め、輸送マシナリーで重要な役割を果たすタンパク質を特定する。
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