2019 Fiscal Year Annual Research Report
Integrated understanding of nitric oxide in yeasts and fungi and its application to microbial
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19H05639
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
高木 博史 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (50275088)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
那須野 亮 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (90708116)
渡辺 大輔 京都大学, 農学研究科, 准教授 (30527148)
萩原 大祐 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (20612203)
高谷 直樹 筑波大学, 生命環境系, 教授 (50282322)
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| Project Period (FY) |
2019-06-26 – 2024-03-31
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| Keywords | 一酸化窒素 / 酵母 / 糸状菌 / 合成制御機構 / 生理機能 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．酵母におけるNOの分子機能の解明
酵母NOS様活性の責任分子と考えられる酸化酵素Oxyを同定する目的で、モノオキシゲナーゼ活性を有する酵母タンパク質を解析した。3種類のP450酵素の遺伝子破壊・発現抑制株を作製し、過酸化水素処理条件下におけるNO合成について、NO反応性蛍光プローブを用いたフローサイトメトリーにより評価した。その結果、ラノステロール-14α-デメチラーゼをコードするERG11の発現抑制株において、NO由来の蛍光が減少した。また、Erg11阻害剤を処理した場合も同様の現象が観察された。以上のことから、ERG11が酵母NOS様活性のOxyをコードする可能性が示唆された。酵母のNO耐性に寄与する新たな遺伝子を探索した結果、リボフラビン合成の初発酵素であるGTP cyclohydrolase II（GCH2）をコードするRIB1遺伝子の過剰発現が、NOドナー処理時の細胞内NO濃度を低下させるとともに、細胞生存率の低下を抑制することを見出し、RIB1を新規なNO耐性遺伝子として同定した。また、組換え酵素を用いた生化学的解析等の結果、GCH2の活性によって生成する代謝中間体（DARP）がNOを消去することを明らかにした。
２．糸状菌におけるNOの分子機能の解明
病原性糸状菌A. fumigatusを対象に、各種ストレス処理時におけるNO産生を解析した。その結果、植物や微生物が産生する天然抗菌物質（ファルネソール、チモール、ピオシアニン等）の処理に対して細胞内にNOが産生されることが明らかになった。麹菌A. oryzaeの転写因子を対象に、NOドナーに対して生育が低下する株を探索した。その結果、エルゴステロール合成系の制御や低酸素応答に重要な転写因子、亜鉛ホメオスタシスやプロリン代謝への関与が予想される転写因子などが候補として見出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
酵母におけるNOS様活性の重要因子であるOxyの候補として、ラノステロール-14α-デメチラーゼErg11を見出した。酵母のNO合成機構を明らかにすることは、本研究の重要課題であるのみならず、真菌におけるNOの生理機能の理解および新たな普遍的NO合成機構の存在という観点から、極めて重要である。また、酵母のNO耐性機構として見出したリボフラビン合成系酵素GCH2依存的な機構は学術的に極めて価値がある。また、微生物に特異的なNO耐性機構であり、抗生物質の薬剤標的として有望であることから、本研究の重要性をより高める成果である。糸状菌についても、抗菌物質処理時のNO産生について機能解析が進み、酵母で得られた知見に基づくNO合成機構に関わる各因子の解析に着手している。また、転写制御因子の網羅的探索系を確立し、NO応答に関与する転写制御因子を明らかにした。以上の理由により、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．酵母におけるNOの分子機能の解明
Oxy候補として同定したErg11を酵母からアフィニティータグ融合タンパク質として精製し、還元酵素として組換え精製Tah18を用いin vitroにてNO合成活性を解析する。また、Tah18、Dre2および本研究で同定するOxyの哺乳類におけるオルソログについて、精製した組換えタンパク質を用いたNOS活性測定や相互作用解析を行い、酵母に見出したNO合成制御機構について生物間保存性の有無を検証する。酵母や糸状菌ではsGCのオルソログが保存されていないため、NOの生理機能の発現にはタンパク質の翻訳後修飾が重要だと考えられる。そこで、NOの生理機能とその分子機構を解析するため、NO依存的に翻訳後修飾を受けるタンパク質をプロテオーム解析により網羅的に同定する。
２．糸状菌におけるNOの分子機能の解明
糸状菌で見出した天然抗菌物質に応答したNO産生の分子機構およびその生理機能について、遺伝子破壊株を作製し、分子遺伝学的手法により迫るとともに、病原菌の感染実験を実施する。麹菌ライブラリーから見出したSrbAおよびAtrRの機能解析を進め、新たなNO耐性機構の解明を目指す。また、薬剤標的として有望な低酸素応答機構との関連性を重点的に検討する。
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