2020 Fiscal Year Annual Research Report
Integrated understanding of nitric oxide in yeasts and fungi and its application to microbial
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19H05639
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
高木 博史 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (50275088)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
萩原 大祐 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (20612203)
渡辺 大輔 京都大学, 農学研究科, 准教授 (30527148)
高谷 直樹 筑波大学, 生命環境系, 教授 (50282322)
那須野 亮 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (90708116)
西村 明 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (30781728)
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| Project Period (FY) |
2019-06-26 – 2024-03-31
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| Keywords | 一酸化窒素 / 酵母 / 糸状菌 / 合成制御機構 / 生理機能 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．酵母におけるNOの分子機能の解明
前年度に、酵母のNO耐性に寄与する新たな遺伝子として、リボフラビン合成の初発酵素であるGTP cyclohydrolase II（GCH2）をコードするRIB1を同定し、組換え酵素を用いた生化学的解析等の結果、GCH2の活性によって生成する代謝中間体2,5-diamino-6-(5-phospo-d-ribosylamino)-pyrimidin-4(3H)-one（DARP）がNOを消去することを明らかにした。今年度は、DARPのピリミジン部位に相当する2,4,5-triamino-6-hydroxy-pyrimidinineの添加により、蛍光強度の上昇が抑制されたことから、DARPがそのピリミジン部位によりNOと反応して分解することで、酵母のNO耐性に寄与することを明らかにした。また、酵母や糸状菌では溶性グアニル酸シクラーゼのオルソログが保存されていないため、NOの生理機能の発現にはタンパク質の翻訳後修飾が重要だと考えられる。そこで、NO依存的に翻訳後修飾を受けるタンパク質をプロテオーム解析により網羅的に同定した。その結果、解糖系のピルビン酸脱炭酸酵素Pdc1やグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素Tdh3がニトロ化されることを見出し、これらの酵素活性がニトロ化により抑制されることも明らかにした。
２．糸状菌におけるNOの分子機能の解明
前年度に、麹菌A. oryzaeの転写因子を対象に、NOドナーに対して生育が低下する株を探索した結果、エルゴステロール合成系の制御や低酸素応答に重要な転写因子（SrbA、AtrR）が候補として見出された。今年度は、A. fumigatusにおいてもSrbAとAtrRの各遺伝子破壊株で、NOドナーに対する生育低下が見られたことから、これら２つの転写因子が糸状菌のNO応答に重要な機能を有していることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NO依存的にニトロ化の翻訳後修飾を受ける酵母のタンパク質を多数同定し、その修飾部位も明らかにした。また、解糖系酵素のPdc1やTdh3の活性がニトロ化で阻害されることが判明した。今後、これらの翻訳後修飾が生理機能（ストレス耐性・発酵能など）に及ぼす影響を解析するが、多数の候補タンパク質を見出し、これらの翻訳後修飾の分子機能が明らかになりつつあることから、研究は順調に進展している。以上の理由により、おおむね順調に進展していると判断した。また、前年度に酵母のNO耐性機構として見出したGCH2依存的な機構は学術的に極めて価値があり、RIB1遺伝子は哺乳類には保存されていないことから、GCH2は新たな抗真菌薬の標的となり得る。糸状菌についても、病原性に重要な転写因子（SrbA, AtrR）は、低酸素応答や薬剤応答に中心的機能を果たしているが、NO応答への関与は報告がない。感染機構を統合的に理解する上で重要な発見であり、NOの生理機能への理解に資するものである。以上の理由により、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．酵母におけるNOの分子機能の解明
前年度にオキシゲナーゼ候補として同定したErg11を酵母からアフィニティータグ融合タンパク質として精製し、還元酵素として組換え精製Tah18を用いin vitroにてNO合成活性を解析する。また、これまでに同定したニトロ化タンパク質の内、Pdc1やTdh3については、ニトロ化の生理機能を明らかにするために、修飾チロシン残基のフェニルアラニン置換体発現株の表現型を評価する。さらに、本研究で見出したNO関連遺伝子の発現改変株およびNO依存的に翻訳後修飾を受ける解糖系酵素の野生型・変異型遺伝子発現株をそれぞれ作製し、NOが生理特性および発酵特性に及ぼす影響を明らかにする。
２．糸状菌におけるNOの分子機能の解明
糸状菌で見出した天然抗菌物質に応答したNO産生の分子機構およびその生理機能について、遺伝子破壊株を作製し、分子遺伝学的手法により迫るとともに、病原菌の感染実験を実施する。また、創薬に資する多様なケミカルスペースの拡充に向け、NO処理による糸状菌の休眠二次代謝の覚醒を検討する。さらに、麹菌ライブラリーから見出したSrbAおよびAtrRの機能解析を進め、新たなNO耐性機構の解明を目指すとともに、薬剤標的として有望な低酸素応答機構との関連性を重点的に検討する。
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