2021 Fiscal Year Annual Research Report
Integrated understanding of nitric oxide in yeasts and fungi and its application to microbial
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19H05639
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
高木 博史 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (50275088)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
那須野 亮 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (90708116)
西村 明 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (30781728)
渡辺 大輔 京都大学, 農学研究科, 准教授 (30527148)
高谷 直樹 筑波大学, 生命環境系, 教授 (50282322)
萩原 大祐 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (20612203)
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| Project Period (FY) |
2019-06-26 – 2024-03-31
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| Keywords | 一酸化窒素 / 酵母 / 糸状菌 / 合成制御機構 / 生理機能 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．酵母におけるNOの分子機能の解明
前年度までに、酵母のNO耐性に寄与する新たな遺伝子として、リボフラビン合成の初発酵素であるGTP cyclohydrolase II（GCH2）をコードするRIB1を同定し、GCH2活性によって生成する代謝中間体（DARP）がNOを消去することを明らかにした。今年度は、日和見感染症の原因である病原性酵母Candida glabrataのRIB1遺伝子（CgRIB1）を同定し、その特性を解析した。その結果、CgRIB1の過剰発現または欠失は、C. glabrataのNO耐性をそれぞれ向上または低下させたことから、GCH2が酵母細胞にNO耐性を付与することが明らかとなった。また、マクロファージ様細胞を用いたり、カイコをモデル宿主とした感染実験により、C. glabrataの病原性にCgRIB1が不可欠であることも示された。
２．糸状菌におけるNOの分子機能の解明
モデル糸状菌Aspergillus nidulansを用い、トランスクリプトーム解析によってNOに応答する遺伝子の探索を行った。その結果、2,313遺伝子の発現量が上昇し、1,076遺伝子の発現量が低下することが判明した。発現上昇した遺伝子の中には、アミノ酸合成系関連遺伝子や推定シトクロムP450遺伝子が多く含まれていたことから、これらの遺伝子がA. nidulansのNO耐性に関与することが示唆された。また、発現上昇比率が上位の遺伝子に着目したところ、推定グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）をコードするgpdCを見出した。本遺伝子の破壊株を用いた解析によって、GpdCは既知のGAPDHとは異なり、高濃度のNOに対して耐性を示し、NOストレス時に解糖系代謝を亢進することでA. nidulansのNO耐性に寄与することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
酵母における新規なNO耐性機構として、①リボフラビン合成系酵素GCH2依存的な機構、②NADPH非依存的な機構をそれぞれ見出した。これらのNO耐性機構はいずれも過去に報告がなく、学術的に極めて興味深い。さらに、GCH2依存的な機構のように微生物に特異的なNO耐性機構については、抗生物質の薬剤標的として有望であることから、本研究の重要性をより高める成果であることから、研究は順調に進展している。糸状菌についても、当初の計画通り、NOによって発現が誘導される遺伝子の網羅的解析を行い、多くのNO関連遺伝子を見出すことができた。特に、特異的なGAPDHおよびシトクロムP450のアイソザイムがNOストレスに関与することは全ての生物を通じて初めての知見であり、ユニークな研究成果が得られることが期待できる。以上の理由により、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．酵母におけるNOの分子機能の解明
これまでにオキシゲナーゼ候補として同定したErg11を酵母から精製し、還元酵素としてTah18を用いin vitroにてNO合成活性を解析する。また、Erg11とTah18の相互作用を解析するとともに、NO合成活性やErg11-Tah18相互作用に対するDre2の影響を評価する。また、Tah18、Dre2および本研究で同定したErg11の多種生物におけるオルソログについて、組換え酵素を用いたNOS活性測定や相互作用解析を行い、生物間保存性の有無を検証する。
２．糸状菌におけるNOの分子機能の解明
野生型株とcpcA破壊株におけるNO処理時の細胞内アミノ酸濃度を測定し、NO処理により存在量が変化するアミノ酸を同定する。また、CpcAの上流経路として知られる翻訳開始因子eIF2αに関して、NO処理時のリン酸化レベルを解析する。一方、シトクロムP450については、基質探索および電子伝達経路を解析する。また、シトクロムP450遺伝子の上流には、シトクロムb5とb5レダクターゼの融合タンパク質をコードする遺伝子が存在し、本融合タンパク質がシトクロムP450のレドックスパートナーであると予想している。そこで、各精製酵素を混合し、シトクロムb5/b5レダクターゼからシトクロムP450への電子伝達機構を詳細に解析する。
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