2020 Fiscal Year Annual Research Report
Comprehensive approach toward understanding cell surface receptor functions coupled with membrane structure and lipid composition
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19H05647
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
佐甲 靖志 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (20215700)
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| Project Period (FY) |
2019-06-26 – 2024-03-31
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| Keywords | 受容体 / １分子計測 / 細胞内情報伝達 / 細胞膜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、最新の１分子計測法などにより、ヒトの主要な膜受容体 (GPCR, RTK) のほぼ全ての分子種について近傍脂質を含めた機能・構造動態の計測・解析を行い、膜の自己組織化による機能制御機構を明らかにすることを目的とする。研究は下記４項目とそれらの統合的な解釈で構成される。本年度の進捗は以下の通りである。
１．膜受容体の細胞膜動態の網羅的な１分子計測：自動化１分子計測装置を改良し、光学系の改造によって均一な広視野観察と安定な自動焦点保持を実現した。計測効率化のため、新設計による計測装置を増設した。Halo tagを融合して蛍光標識したヒトRTK50種のパイロット計測を開始した。
２．膜脂質と受容体の超解像可視化：RTKの一種EGFRとPS, PIP2の共局在計測を行い、受容体の活性化に伴うPLC gammaの活性化によって、EGFRとPIP2の共局在率が減少することを明らかにした。PALM法による多色超解像データ解析のパイプラインを構築し、計測効率を10倍以上改善すると共に、従来のK functionによる平均的な共局在計測に加えて、画像データによる局所的な共局在ドメイン解析の方法を開発した。
３．膜受容体の境界脂質の分析：細胞膜から特定受容体周りの脂質をSMAナノディスクとして切り出し、受容体に融合したtagを利用して精製する方法の検討を進めた。EGFRを含むナノディスクから抽出した脂質を質量分析し、受容体活性化の前後で脂質組成が変化するという予備的結果を得た。
４．再構成膜における膜受容体の脂質制御の解析：EGFRの膜内・膜近傍ペプチドの２量体・多量体化が、受容体のスレオニンリン酸化、周辺のコレステロールおよび酸性脂質の３者の関係によって複雑に変化し、受容体の機能制御を行っていることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究はどの項目も概ね順調に進行している。１分子計測は網羅的な自動計測へ向けた予備計測を開始した。試料調整については、RTKの安定発現株作成まで進行し、予定以上に進捗した。顕微鏡装置の作成は自動焦点装置の導入に手間取り、昨年度研究費の繰り越しも行ったが、今年度には導入が終了し期待通りの性能向上がみられ、ウェルプレート全体を安定に計測できるようになった。超解像法による受容体と脂質の相互作用計測は、EGFRに関して、受容体の自己制御的な周辺脂質書き換えが機能と相関していることが明らかになった。SMPナノディスクでの構造計測、生細胞における１分子計測の結果と統合することにより、膜受容体による膜の自己組織化と機能発現の関係が明らかになる時対される。また、GPCRやイオンチャネルに関しても類似の現象が見つかりつつある。SMAナノディスク法は、予備計測によって脂質分析を実現するための条件が明らかになった。その他、関連する研究として4種のERBB familyの機能分化を解析し、入力に依存した受容体間の相互作用変動や、下流分子との相互作用ダイナミクスを明らかにした。これらの研究結果は、今後の研究指針を決定する重要な情報である。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度は以下の様な研究計画で、各研究項目をさらに進捗・発展させる予定である。
１．膜受容体の細胞膜動態の網羅的な１分子計測:蛍光標識可能な50種のRTKそれぞれを発現するHEK293細胞において、RTK分子動態の１分子計測を行う。計測データから側方拡散運動と会合体形成を隠れマルコフモデルを用いて解析し、種々の動態パラメータを得る。いくつかの代表的受容体については細胞内分子との相互作用など詳細な１分子解析を行い、多量体化による活性化機構を明らかにする。
２．膜脂質と受容体の超解像可視化：３色のPALM/STORM法によるEGFRとPS, PIP2の機能依存的な共局在変化に関する成果をとりまとめ、外部発表する。網羅的なPALM計測技術を最適化し、種々のRTK、膜脂質PS, PIP2との共局在計測を行い、活性化と周辺脂質の組成変化の一般性を検討する。
３．膜受容体の境界脂質の分析：細胞膜からERBB (EGFR family) 周りの脂質をSMAナノディスクとして切り出し、精製して薄層クロマトグラフィーおよび質量分析法で脂質種分布を計測する。また、SMAを化学修飾してガラス基板へ結合し、ナノディスク内での１分子可視化計測を行うための試料作成法を開発する。
４．再構成膜における膜受容体の脂質制御の解析：精製した受容体をMSPナノディスクに再構成し、脂質組成による構造・機能変化を１分子FRET法で計測する。EGFRの膜内・膜近傍ペプチドの多量体化に対するコレステロールおよび酸性脂質の効果に関する論文発表を行い、さらに全長受容体分子の再構成系を用いた構造・反応計測を行う。
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[Journal Article] Biphasic spatiotemporal regulation of GRB2 dynamics by p52SHC for transient RAS activation2021
Author(s)
Yoshizawa,, R., Umeki,, N., Yamamoto, A., Murata, M., and Sako, Y.
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Journal Title
Biophysics and Physicobiology
Volume: 18
Pages: 1~12
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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