2019 Fiscal Year Annual Research Report
植物病原糸状菌の抗ウイルスRNAiにおけるArgonauteの機能分担機構の解明
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19J00261
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
佐藤 有希代 岡山大学, 資源植物科学研究所, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | 菌類ウイルス / 植物病原糸状菌 / RNAi / RNAサイレンシング / Dicer / Argonaute / プラス鎖RNAウイルス / 2本鎖RNAウイルス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，菌類-ウイルス相互作用のモデル糸状菌であるクリ胴枯病菌を用いて，抗ウイルスRNA干渉 (RNAi) 機構におけるArgonauteタンパク質の役割分担や必要性がウイルスに応じて異なる可能性を検討している．先行研究において，クリ胴枯病菌が持つ2つのDicer様タンパク質遺伝子 (dcl1, dcl2) と4つのArgonaute様タンパク質遺伝子 (agl1, agl2, agl3, agl4) のうち，Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1, ハイポウイルス科) に対する抵抗性には，dcl2とagl2が必要であることがわかっていた．一方で，Rosellinia necatrix victorivirus 1 (RnVV1, トティウイルス科) に対する抵抗性には，dcl2は必要とされるが, agl2は寄与しない可能性が示されていた．そこで本研究において，RnVV1に対する抵抗性にagl2以外のagl遺伝子が寄与するか検討するため，本菌の相同組換え用系統であるDK80系統を遺伝的背景として，4つのagl遺伝子の単独ならびに多重破壊株を作製した．これらagl遺伝子の各単独破壊株や多重破壊株は，培地上でDK80系統と同等の栄養生長を示した．各系統にRnVV1を接種し，ノーザンハイブリダイゼーションによりウイルスRNA蓄積量を解析した．すると，dcl2遺伝子破壊株 (Δdcl2) では明らかなRnVV1由来RNA蓄積が認められた一方で，agl遺伝子単独・多重破壊株ではDK80系統と同様にRnVV1由来RNAが検出されなかった．よって本菌からのRNAiによるRnVV1排除は，Argonaute非依存的機構によることが示唆された．
また，本研究への供試材料とすることを想定して，新規ウイルスの同定・特徴づけを行うとともに，これらウイルスをクリ胴枯病菌に接種することを試みた．これらの成果を原著論文および学会で発表した (業績一覧)．特筆すべき結果として，フザリウム萎凋病菌から，分子実体がユニークである新規ウイルス（タンパク質外殻を持たない可能性が高いが，11本もの分節ゲノムRNAを持つ）を見出した（論文投稿中）．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
RnVV1に対するRNAiにおいてagl2遺伝子が必要とされない理由として，2つの対立的な仮説 ［① 他のagl遺伝子が単独または冗長的に抗ウイルスRNAiの役割を担うため，② Dicer様タンパク質による2本鎖RNA切断機構がウイルス複製を十分に阻害することで，下流のArgonaute様タンパク質の機能が必要とされないため］を想定していた．本年度の解析から，仮説①の可能性は低く，仮説②の可能性が高いと考えられた。以上のように仮説を絞り込むことができたため，おおむね順調に進展していると考えている．
また本年度は，新規ウイルスの単離・同定プロジェクトにおいて，多様なウイルスに対する菌類RNAi鍵因子の役割を俯瞰的に理解するための様々な研究材料を得ることができた．これら新規ウイルスや受入研究室のウイルスコレクションを次年度の解析材料として用いる予定である．中でもウイルス学的に新規性の高い研究材料として，典型的なタンパク質外殻を持たない可能性が高い多分節型RNAウイルスを2種 (フザリウム萎凋病菌，ペニシリウム属菌から1種ずつ) 見出すことができた．これらウイルスが宿主RNAiの標的となるのか，どのようにゲノムRNAや複製中間体を保護しているのかは，今後の研究課題として興味深い．
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は，仮説②の妥当性をさらに検討するため，Δdcl2菌株に再びdcl2遺伝子を相補する実験を行う．この際，誘導性プロモーターを用いて菌体内のDicer様タンパク質蓄積量を操作する実験系を構築することを試みる (本菌で同様の系は確立されていないため，挑戦的である)．また，qRT-PCRを用いてより定量的にウイルス蓄積量を評価する. さらに次年度は，Argonaute不要の抗ウイルスRNAi機構がどのようなウイルスの感染において働くか，様々なウイルスを接種することで検討する．RnVV1は，白紋羽病菌由来のトティウイルス科2本鎖RNAウイルスである．前年度に単離・特徴付けを報告したウイルスや，受入研究室の多様なウイルスコレクション [クリ胴枯病菌や白紋羽病菌由来の2本鎖RNAウイルス (レオウイルス科，メガビルナウイルス科，パルティティウイルス科など) や1本鎖のプラス鎖RNAウイルス (ハイポウイルス科)] を用いる．前年度から引き続き，本研究への供試材料として役立てるため，受入研究室において単離された新規ウイルスの特徴付け (感染性分子実体や宿主への病徴等の解析) を進める．
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[Journal Article] ICTV virus taxonomy profile: Megabirnaviridae2019
Author(s)
Yukiyo Sato, Naoyuki Miyazaki, Satoko Kanematsu, Jiatao Xie, Said A. Ghabrial, Bradley I. Hillman, Nobuhiro Suzuki, ICTV Report Consortium
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Journal Title
Journal of General Virology
Volume: 100
Pages: 1269～1270
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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