2019 Fiscal Year Annual Research Report
精子形成に至る始原生殖細胞の系譜動態と不均一性：単一細胞解像度での解明
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19J00410
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
池田 達郎 基礎生物学研究所, 生殖細胞研究部門, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | マウス / 生殖細胞 / 発生 / 細胞系譜 / バーコード |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではタモキシフェン（Tam）誘導型Creレコンビナーゼ（MerCreMer）の活性により細胞にバーコードが導入されるマウス（バーコードマウス）を用いる。始原生殖細胞（PGC）へ特異的にバーコードを導入するため、準備としてPGC特異的にMerCreMerを発現するトランスジェニックマウスを作製していた。まずこのマウスをGFPレポーターマウスと交配させ妊娠中の母体にTamを投与することで、組み替えによるGFPの発現がPGC特異的に生じることを確認した。次にバーコードマウスと交配して組み替えの条件を検討した。Tamの代謝物である4OH-Tamを用いて、短い時間内に安定してPGCへバーコードを導入できる実験条件を決定した。これにより本計画の鍵となる実験系を構築し、これまで不可能であった生殖細胞の系譜動態の定量的な解析が可能となった。
この実験系を用いてPGCの発生初期（E6.5）にバーコードを導入し、その後の胎仔、生後0週、1週、3週、8週の各発生段階の複数個体の精巣をそれぞれサンプリングした。精巣DNAに含まれるバーコードを次世代シーケンシングし、情報学的・統計学的に解析した。その結果、初期PGCに導入したバーコードの発生に伴う種類の減少が確認され、PGCのごく一部の系譜のみが成体まで維持されている可能性が示された。また、PGCの発生後期（E11.5）にバーコードを導入したマウスでも生後1週、3週、8週におけるバーコードの分布を解析し、生後1週以降では系譜の分布に大きな変化が生じないことが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新規MerCreMerマウスによる生殖細胞特異的な組み替えをGFPレポーターとの交配実験により確認し、またMerCreMerマウスとバーコードマウスを用いて最適なバーコード導入の条件を決定できた。この実験系でバーコード分布の予備データを取得した結果、仮説を支持するようなバーコードの発生に伴う減少を見出すことができた。
FACSを用いた生殖細胞と体細胞の分取によるバーコード導入の検証、および単一細胞ごとのバーコードの計測には至らなかったが、生殖細胞レポーターとバーコードマウスの二重遺伝子導入系統の作出とFACSによる細胞分取の条件検討が進んでおり、遠からずデータの取得が期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
生殖細胞と体細胞の分取実験によりPGC特異的なバーコードの導入を確証し、バーコードが導入されるPGCの割合を調べる。
初期PGCにバーコードを導入し、さらに複数の個体のバーコードを解析して、細胞系譜の減少がどの程度の規模で起こっているのかを統計学的に推定する。また後期PGCにバーコードを導入した個体を胎仔の段階でサンプリングし、生後に至るまでの系譜の減少を解析する。大きな系譜の削減が期待できる発生段階を細かく区切ってバーコードを解析し、削減がまさに行われる時期を推定する。
バーコードの総体的な次世代シーケンシングに加え、単一細胞にソートしてのバーコードのシーケンシングをおこない、系譜のクローナルな拡大の不均一性を評価する。
削減の時期と規模がわかったら、単一細胞のバーコードと遺伝子発現を同時計測する実験系を確立し、成体まで維持されるPGCクローンが持つ性質を探索する。
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