2020 Fiscal Year Annual Research Report
Lineage dynamics and heterogeneity of primordial germ cells contributing spermatogenesis
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19J00410
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
池田 達郎 基礎生物学研究所, 生殖細胞研究部門, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | マウス / 始原生殖細胞 / 精子幹細胞 / バーコード / 細胞系譜 / クローン拡大 / トランスクリプトーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2019年度に始原生殖細胞（PGC）でTamoxifen依存的に厳密にバーコードを導入する実験系が完成していた。2020年度はまずPGCで蛍光レポーターを発現するマウスを用いてPGCと体細胞をFACSにより分取し、含まれるバーコードをSequelシーケンスして、バーコードがPGC特異的に導入されていることを確認した。
E6.5の誘導直後の数十個のPGCにバーコードを導入した場合、胎仔から新生児にかけてバーコードの種類が減少することを示唆するデータが昨年度に得られていた。これを確認するためにさらに複数の胎仔から精巣を取得し含まれるバーコードをSequelで測定した。すると、2019年度の結果とは異なりE12.5の胎仔から8週齢の成体にかけて明確なバーコード数の減少は見いだされなかった。2019年度の胎仔については、バーコードが通常より遅い発生段階で成立したことの確証が得られている。E11.5にバーコードを導入して胎仔と成体のバーコード数を比較する実験も進行しており、この結果からも、精巣に入ったほとんどのPGCは多少なりとも幹細胞を生じ子孫細胞が成体まで維持されるという説が支持されつつある。
他方で、E6.5の個々のPGCは胎仔の段階で大きく子孫細胞が増えたものとそうでないものの連続的な不均一性を生じることが示唆されている。これに関係して、E6.5でバーコードを導入したオスの成体を多数のメスと交配させ、数百の産仔に現れるバーコードをサンガーシーケンスで測定しており、一部のPGCに由来する仔が優先的に生じていることを示唆するデータが得られつつある。
以上の実験で得られた膨大なデータは共同研究者に提供して綿密に議論し、数理解析手法の発展にも積極的に貢献している。
また、結果の統計評価に必要なPGC数のばらつきと時間変化を画像解析により計測する系を共同研究者と開発中であり、条件が整いつつある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
バーコード数を測定する実験に予想以上の時間がかかったため、当初期待していた、個々のPGCに含まれるバーコードと遺伝子発現を同時測定する実験が開始できなかった。しかし、この実験の実現可能性を飛躍的に向上させる新規マウスを共同研究者が開発し、供与いただいたので、2021年度にはファーストトライができると考えている。
また、これまでは胎仔精巣に含まれるPGCの割合が非常に小さいため、精巣全体のバーコードシーケンスでは十分な情報を得られず、解析の進展に遅れが生じていた。2020年度にPGCのバーコード配列を特異的にエンリッチする実験系を構築し、得られる情報量を大幅に増やすことが可能となったので、2021年度ではデータの取得が加速し大きく生物学的理解の進展につなげられると期待している。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在得られているサンプルについて必要に応じてバーコードのリシーケンスをおこない十分な情報を得たのち、数理統計学的に評価して生殖細胞の系譜動態を議論する。このとき必要に応じてさらにサンプル数を追加してバーコードを測定する。
個々のPGCの子孫細胞の不均一性をさらに正確に評価するため、数百の単一PGCをソートしバーコードをサンガーシーケンスする。Sequelシーケンスの結果とも比較し、測定手法によってどの程度のバイアスが存在しうるかを評価する。
バーコードを導入したオスの仔をさらに継続して取得しバーコードを計測する。仔が得られなくなった段階でオスの精巣を再材し含まれるバーコードを計測して、精巣に含まれるバーコードの何割が実際の仔に至ったのかを評価する。
以上の結果が十分に揃った段階で成果を一度論文にまとめることを目指す。
並行して、単一PGCに含まれるバーコードと遺伝子発現を同時測定する実験系を構築し、PGCの子孫細胞の拡大と遺伝子発現の相関を解析していきたい。
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