2019 Fiscal Year Annual Research Report
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19J00865
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| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
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Principal Investigator |
櫻井 伸行 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | 精子成熟 / 精巣上体 / マウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、牛の受胎率の低下に起因して畜産物の生産コストが増大しており、これが生産者および消費者の負担に繋がっている。受胎率の低下の一因と考えられるのが雄の生殖能力の低下である。精巣で作られて間もない精子はそのままでは受精できないが、精巣に隣接する管状の器官「精巣上体」を通過する過程で受精能力を獲得する（精子成熟）。管内は糖タンパク質などを含んだ分泌液で満たされており、この中に精子成熟の責任因子が存在すると予想される。こうしたメカニズムを分子生物学的に解析する上では遺伝子組換え技術が大いに役立つが、牛などの大型動物に応用するには未だに制限がある。同じ哺乳動物のマウスにおいて、遺伝子発現パターンのin silico解析の結果などから、精子成熟への関与が疑われる遺伝子が複数見つかっている。本研究では、CRISPR/Cas9システムを利用してこれら候補の遺伝子欠損（KO）マウスを作製し、雄性不妊を呈した系統について解析を行うことで、精子成熟を制御する分子メカニズムの解明を目指す。
全身各組織のサンプルを用い、候補遺伝子のRT-PCR解析を行うことで各遺伝子の発現パターンを調べた結果、候補遺伝子は全て精巣上体で高発現あるいは特異的な発現を示すことを明らかにした。8つの遺伝子領域をターゲットとして、Cas9タンパク質とそれぞれの標的gRNAの複合体をエレクトロポレーション法によって受精卵に導入し、この卵を偽妊娠マウスに移植することで遺伝子改変マウスを得た。数世代の交配を重ね、得られたホモ変異体の雄マウスと野生型の雌マウスを交配試験に供した。その結果、試験を実施した8系統のうち4系統について、ホモ変異体の雄と交配した雌マウスから得られた産仔数が、野生型の雄マウスと交配した雌の産仔数と比較して有意に減少しており、これらの遺伝子が雄の妊孕性に重要な役割を果たすことが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「研究実績の概要」に記載した通り、精巣上体で起こる精子成熟を制御する分子メカニズムの解明を目指して、精巣上体で特異的に発現する遺伝子について、8系統のKOマウスを樹立に成功した。変異マウスを解析した結果、4系統では雄の生殖能力に異常が認められ、これらの遺伝子が雄の生殖能力に重要な役割を担うことが明らかになった。変異を導入しても明確な表現型を得られなかった系統に関しても、雄の生殖能力に関する基本的な検定を行い、検証結果を学術誌に発表した。表現型が得られた系統については、論文の投稿に向けて、引き続き必要なデータを収集しているところである。
以上のように、現在のところ研究は当初の計画通りに進展していることから、「おおむね順調に進展している」と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
生殖能力異常の原因を探るため、令和2年度は以下に示す実験を行う。
1. 精巣および精巣上体の組織観察。精巣および精巣上体の組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行なった上で、各組織における異常の有無を観察する。特に、精細管内でおこる精子形成の様子や精巣上体管内の精子の貯留具合について観察する。
2. 精子の形態観察および運動性解析。精巣上体で起こる精子の特徴的な変化として、運動性の獲得が挙げられる。精巣上体を通過し、貯留された精子の形態に異常がないか、精子の塗抹標本を作製して観察する。さらに、コンピューター（CASAシステム）を用いて精子の運動性に異常がないか解析する。
3. 精子の受精能力の検討。精子自体の受精能力に異常がないかを調べる目的で、ホモ変異体の精子と野生型の卵を用いて体外受精を行なう。受精は、1）精子が卵を取り巻く卵丘細胞層を通過した後、2）透明帯を通過し、3）卵細胞膜と精子が融合することで成り立つ。それぞれのプロセスにおいて異常の有無を調べるために、卵丘細胞が付着した条件、卵丘細胞を除去した条件、卵丘細胞および透明帯を除去した条件のそれぞれにおいて体外受精を行なう。
4. 雌生殖道内における精子の挙動観察。体外においてホモ変異精子が受精能力を有する場合、妊孕性の異常は雌生殖道内において特異的に起こるイベントに関連していると考えられる。子宮内に射出された精子は、その後、受精の場である卵管膨大部へ移行するが、子宮と卵管の結合部は著しく狭い構造をしており、ある種の異常を持つ精子はこの結合部を通過できないことが知られている。精子に蛍光タンパク質を発現させることで、雌生殖道内における精子の挙動を観察する手法が既に確立されている。この手法を用いることで、現在解析中のホモ変異精子の雌生殖道内での挙動を解析する。
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