2020 Fiscal Year Annual Research Report
医薬資源として有望なヒドロキサム酸を合成する酵素の機構解明と合理的改変法の確立
| Project/Area Number |
19J00870
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
永田 隆平 東京大学, 大学院農学生命科学研究科, 特別研究員(PD)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
|
| Keywords | X線結晶構造解析 / トリコスタチンA / 放線菌 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
2020年度は、トリコスタチンAの末端ヒドロキサム酸基の生合成に関わるTsnB6, TsnB7では、コンストラクトの改善を進めた。昨年度の研究で2つの酵素はヘテロ二量体と四量体をつくることを明らかにしており、そのことが結晶化を妨げると考えられた。そこで、両酵素の末端領域を欠失させることで、改善を試みた。その結果、TsnB7のN末領域の欠失によりヘテロ二量体のみにすることに成功した。よって、このN末領域が四量体化に重要であると判明した。また、このコンストラクトは活性を維持し、溶液状態で非常に安定だった。現在、結晶化スクリーニングを進めている。
カルボキシル基をヒドロキサム酸基に変換する酵素TsnB9では、トリコスタチン酸以外のカルボン酸化合物を用いて基質特異性を調べた。TsnB9は、炭素鎖長の異なる脂肪酸やケイ皮酸を基質として受け入れたことから、疎水性が高い基質を好むことが示唆された。一方、炭素鎖の両端にカルボキシル基をもつ基質では反応が進行しなかったため、複数の親水性官能基をもつ基質は好まないことが示唆された。また、TsnB9と基質との共結晶化を行い、キレイな単結晶が得られた。この結晶から2.98オングストローム分解能のフルデータを収集できたが、データの質が悪く構造決定には至っていない。
加えて、スクアレン合成酵素とよく似た放線菌由来の新規芳香族プレニル基転移酵素CqsB4とLvqB4の変異体解析を行った。共同研究者が決定したLvqB4の基質結合型構造に基づいて変異を導入し、活性を調べた。それにより、プレニルドナーの二リン酸と相互作用している残基が酵素反応に重要であることが確かめられた。また、プレニルアクセプター近傍にある水分子とヒスチジンおよびアスパラギン酸残基がcatalytic triadのように働いて脱プロトン化を行うと予想された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
TsnB6-B7の四量体化に重要な領域やTsnB9の基質特異性に関する知見が得られた一方で、TsnB6-B7複合体では結晶が得られておらず、TsnB9はフルデータ収集までできているものの構造決定に至っていない。このような状況から、やや遅れていると判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
TsnB9の基質特異性について詳細に調べるために、それぞれの基質に対する比活性を生成物の一つであるAMPの検出により定量的に測定する。結晶構造解析では、アミノ酸またはアミノ酸誘導体の添加による結晶化時のタンパク質凝集の抑制（蛋白質科学会アーカイブ, 1, e046, 2008）や抗凍結条件の最適化により、質の高い結晶の取得および構造決定を目指す。
|
