2019 Fiscal Year Annual Research Report
All-Viralなゲノム編集を通じた睡眠量の恒常性を制御する脳領域の解明
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19J00933
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
宮脇 健行 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | AAV |
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| Outline of Annual Research Achievements |
計画通り、AAV-PHP.eBを静脈注射することによって遺伝子を発現する実験系を確立した。また、プロトコル整理と普及を行い、自身が確立した系を研究室の主要な実験方法にすることに貢献した。
また、10種のプロモーター候補配列をクローニングし、透明化を用いて、プロモーター候補配列によって制御される蛍光タンパク質の発現パターン評価を行った。結果、それぞれ特徴的な発現パターンを示したものの、いずれも期待していたよりも発現の特異性が低いことがわかった。上記の結果を踏まえ、予備的なアプローチとして、細胞種特異的に組み換えタンパク質Creを発現する遺伝子改変動物を数種類見繕い、導入を行った。これにより、Cre依存的に組み変わることによって初めて搭載遺伝子を発現するようなウイルスを適用すれば、特定の脳領域にAAVに搭載した遺伝子を発現可能となった。
並行して、発現させることによって睡眠表現型を変化させるための候補分子として、ノックアウトによって睡眠表現型が変化することが知られている分子、CaMK2aをAAV-PHP.eBによって発現させた。結果、CaMK2aの疑似リン酸化状態依存的に睡眠表現型が変化することを、呼吸パターン、および脳波のパターンから同定した。更に、in vivoでCaMK2aが取る状態と睡眠表現型の対応付けを取るためのスクリーニング系を提案し、実際に検証をすることで、CaMK2aに未知の制御領域があり得ることを示唆した。これらの研究成果により、CaMK2aが眠気を測定するための分子メカニズムを解明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究成果自体は期待以上に出たものの、申請者が当初提案した研究とは乖離が生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
表現型を制御する脳領域をAll-Viralに解明するためには、ウイルスに搭載可能で特徴的な発現パターンを示すプロモーター/エンハンサーを同定するか、特徴的なトロピズムを示すウイルスカプシドを作成することが必要である。これを実現するために、配列と表現型のmultiplexな比較を可能とする、シングルセル解析の技術を習得し、応用する。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Visualization and molecular characterization of whole-brain vascular networks with capillary resolution2020
Author(s)
Miyawaki, T., Morikawa, S., Susaki E.A., Nakashima, A., Takeuchi, H., Yamaguchi, S., Ueda, H. R., Ikegaya, Y.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 11
Pages: 1104
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] SeeNet: Hybrid Hydrogel and Tissue Clearing for Molecular and Structural Characterization of Cerebral Vasculature2019
Author(s)
Miyawaki, T., Susaki, A., E., Yamaguchi, S., Ueda, R., U., Ikegaya, Y.
Organizer
Society for Neuroscience 2019
Int'l Joint Research
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[Presentation] SeeNet: A Method for Whole-brain Visualization of Molecularly Characterized Vascular Network2019
Author(s)
Miyawaki, T., Susaki, A., E., Yamaguchi, S., Ueda, R., U., Ikegaya, Y.
Organizer
Neuro2019
Int'l Joint Research
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