2020 Fiscal Year Annual Research Report

Biochemical characterisation of GPMVs and their application to biofunctional materials.

Research Project

Project/Area Number	19J20051
Research Institution	Kumamoto University
Principal Investigator	岡田咲耶熊本大学, 自然科学教育部, 特別研究員(DC1)
Project Period (FY)	2019-04-25 – 2022-03-31
Keywords	細胞外小胞 / extracellular vesicles / エクソソーム / exosome / drug delivery system / DDS / ケミカルバイオロジー / シアリダーゼ
Outline of Annual Research Achievements	細胞外小胞Extracellular Vesicles（EVs）の中で最も大型であるGiant Plasma Membrane Vesicles（GPMVs）は、膜表面の脂質やタンパク質の集合・離散に関する解析は進んでいるものの、構造や生理機能を詳細に解析した研究事例は少ない。仮に、GPMVs内に、多量の生体高分子や細胞小器官を含有させることができれば、より多くの物質を輸送できる新しい薬物送達システム（DDS）の構築も夢ではない。私は、こうしたGPMVsの応用ポテンシャルの高さに魅力を感じ、GPMVsに関する研究を行なっている。研究を始めるにあたり、安定かつ効率的なGPMVsの調整法の確立が不可欠であった。そこで、膜に作用しやすい両親媒性に注目して薬剤を探索した結果、paraformaldehyde (PFA)とdimethyl sulfoxide (DMSO) により、ダイナミックな膜動態の変化を誘導でき、効率的な条件を確立することが出来た（Okada et al. 2020）。誘導したGPMVsについて、蛍光試薬を用いた解析やプロテオミクス解析、RNA解析を用いて、生化学的な構造解析を行った（Okada et al. 2018）。また、GPMVsのDDSへの応用を目指して、精製したGPMVsを培養細胞へ効率よく取り込ませる条件の検討も行った。細胞膜の構成成分であるリン脂質、タンパク質、糖鎖のそれぞれに対する分解酵素を用いて、GPMVsの細胞表層へのドッキング効率を調べた。その結果、糖鎖分解酵素（a2-3,6,8 neuraminidase）を使用した際に、GPMVsの細胞表層へのドッキング効率が約2倍に上昇し、更にGPMVsの内容物の細胞への移行効率も約6倍に上昇した（論文作成中）。糖鎖処理によってGPMVsと細胞の相互作用を促進させられる可能性を見出した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 昨年度までに、GPMVsの生成効率を大きく向上させ、GPMVs研究における技術的基盤を築いた。本年度は、研究項目1）化学物質および酵素処理によるGPMVsの細胞への取り込みの効率の検討　研究項目2) GPMVsの細胞への取り込み機構の解明を行った。研究項目1) 細胞膜の構成成分であるリン脂質、タンパク質、糖鎖のそれぞれに対する分解酵素を用いて、GPMVsの細胞表層へのドッキング効率を調べた。その結果、糖鎖分解酵素（a2-3,6,8 neuraminidaseとPNGaseF）を使用した際に、GPMVsの細胞表層へのドッキング効率が約2倍に上昇し、更に、GPMVsの内容物の細胞への移行効率が約6倍に上昇した（論文作成中）。a2-3,6,8 neuraminidaseはシアル酸特異的に分解するシアリダーゼの一種であり、シアル酸特異的レクチンを用いた染色の結果、膜表層のシアル酸量の減少が示唆された。シアル酸は負電荷を帯びていることから、細胞表層の電荷を抑えることが、GPMVsと細胞の相互作用の促進に重要であると考えている。研究項目2）a2-3,6,8 neuraminidas処理条件下において、取り込み機構を調べるために、カルボシアニン色素DiOを用いて膜を標識したGPMVsを細胞に添加し、ドッキング後のGPMVsの形態変化を観察した。その結果、GPMVsと細胞のドッキングサイトにおいて、DiO蛍光を示すチューブ様構造が頻繁に観察された。また、免疫染色法による解析の結果、GPMVsの内部でα-tubulinが検出された。これより、GPMVsと細胞は相互作用する際に、中間構造としてα-tubulinにより支えられたチューブ構造を形成し、チューブ構造を介して物質の移行を起こす可能性が示唆された。今後、チューブ構造のより詳細な解析を進めていく。
Strategy for Future Research Activity	本年度、受容細胞の膜表層の糖鎖に対して処理を行うことで、GPMVsと細胞の相互作用が促進されることを見出した。また、糖鎖処理した条件下において、GPMVsと受容細胞間でチューブ様構造が観察され、更にα-tubulinが検出されたことから、GPMVsと受容細胞の相互作用は、新たな膜融合の様式を取る可能性が示唆された。そこで、今後は、研究項目1) チューブ構造のより詳細な分子基盤解析　研究項目2) in celluro におけるGPMVsを介した物質輸送の検討　を進めていきたいと考えている。研究項目1) チューブ構造の分子基盤の解析にあたって、時間経過によるチューブ構造の形成過程の観察を試みた。しかしながら、細胞の増殖により、特定のGPMVsを追跡することが困難であった。そこで、過剰チミジンを投与することで細胞増殖を抑制した条件において、細胞表層のGPMVsの挙動を観察することを考えている。また他の解析方法としては、本学内の共通機器を使用、あるいは共同研究等により、生細胞解析システム（IncuCyteなど）を用いることで、通常の培養条件下におけるGMVsの挙動、そして、チューブ構造の形成過程の解析を行いたいと考えている。研究項目2) GPMVsの薬物送達システム（DDS）への応用を目指して、in vitroで得られた結果を基に、in celluroでの実験を進めたいと考えている。これまでの研究結果より、GPMVsは膜表層にa2-6シアル酸の少ない細胞に取り込まれやすいと考えられる。生体内において、細胞表層におけるシアル酸量の少ない細胞は、脾臓と卵巣であることが報告されており（Ohmi Y et al. Net. Commun. 2016）これらの器官に取り込まれる可能性が考えられる。抗がん剤を内包したGPMVsを腫瘍を持ったマウスに投与し、腫瘍に対する作用を調べていきたい。