2020 Fiscal Year Annual Research Report
プリン作動性Ｐ２Ｙ６受容体多量体形成の生理学的意義の解明
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19J20086
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| Research Institution | The Graduate University for Advanced Studies |
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Principal Investigator |
下田 翔 総合研究大学院大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | 超硫黄分子 / CARS2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまで、Gタンパク質共役型のプリン作動性P2Y6受容体（P2Y6R）の環境変化に伴う酸化還元（レドックス）修飾が受容体の機能や心臓のホメオスタシスに与える影響について研究を進めてきた。P2Y6R欠損マウスの心臓および心筋細胞特異的P2Y6Rを過剰発現させたマウス心臓は、ともに圧負荷ストレスに対する抵抗力が低下し、重度の心不全を呈することを報告した（Sci. Rep., 2020）。興味深いことに、P2Y6R阻害剤MRS2578がP2Y6Rとコバレントに結合することで細胞膜上のP2Y6Rを内在化させ、その結果、リガンド応答を減弱させることも明らかにした（論文投稿中）。その過程で、電子供与性の高い硫黄原子を中心としたシステインのポリイオウ化修飾がタンパク質の機能制御に重要であることがわかってきた。また、動物細胞において、システイニル転移RNA合成酵素（CARS2）が主たるタンパク質過イオウ化酵素として働くことが共同研究から明らかにされた。また、CARS2はシステインパースルフィドや、タンパク質中のシステインポリスルフィドなどの過硫黄分子種（ここでは超硫黄分子と呼ぶ）の形成にも関わることがわかってきた。そこで、CARS2欠損マウスと心筋虚血再灌流モデルを掛け合わせることで、心臓におけるCARS2を介する超硫黄分子生成の病態生理的役割について解析を行った。
CARS2ホモ欠損マウスは胎生致死であるため、CARS2ヘテロ欠損マウスを用いた。CARS2ヘテロ欠損マウスの心臓冠動脈を結紮し、虚血を誘発させたところ、野生型マウスと比較して虚血再灌流後の心機能が著しく低下する傾向が認められた。以上の結果は、CARS2が虚血性心疾患の病態形成に重要な役割を果たしている可能性を示している。現在、CARS2による超硫黄分子形成と心筋の虚血ストレス耐性との関係を解析している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
心臓におけるシステイニルtRNA合成酵素（CARS2）およびシステインパースルフィドやシステインポリスルフィドなどの含硫黄分子種（超硫黄分子）の役割について調べるため、まずは野生型マウス心臓に15分の虚血後、24時間の再灌流を行う虚血再灌流モデルを適用し、心臓における超硫黄分子の検出を質量分析によって行った。その結果、虚血再灌流ストレスを誘導した心臓の左心室壁（虚血領域）では、システインやシステインパースルフィドなどの超硫黄分子の量が変化していることを見出した。右心室壁や心室中隔壁（非虚血領域）ではこれらの超硫黄分子の変化は見られなかった。このことから、超硫黄分子が虚血再灌流ストレス誘導性心不全の病態形成に関与することが示唆された。超硫黄分子を合成する酵素の一つとしてCARS2が挙げられるので、次にCARS2欠損マウスを用いて心臓での表現型解析を行った。病態を発症しない状態でのCARS2欠損マウスの心機能や心臓の構造については野生型マウスと比較して違いは認められなかった。その一方で、CARS2欠損マウスに虚血再灌流モデルを適用すると、CARS2欠損マウスでは野生型マウスと比較して虚血再灌流後の心機能に差異が認められた。
以上の結果は、超硫黄分子やそれを産生するCARS2が心不全の病態形成に関与している可能性を示せているため、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究で行った質量分析では、低分子量の超硫黄分子が虚血再灌流ストレスによって変化するという結果を得た。一方で、超硫黄分子を可視化する蛍光プローブを用いると、質量分析で得た結果とは逆の結果となった。質量分析では、低分子の超硫黄分子しか追跡できておらず、蛍光プローブによる結果を踏まえると、タンパク質中の超硫黄分子量の変化についても調べる必要がある。そこで、虚血再灌流ストレスによって顕著にポリイオウ化あるいは脱イオウ化を起こすタンパク質を同定し、その機能変化について解析する。
CARS2はミトコンドリアに局在することが知られているタンパク質である。したがって、CARS2欠損マウスではミトコンドリアに変化が起こる可能性がある。そこで、電子顕微鏡等を用いて、CARS2欠損マウス心臓のミトコンドリア形態の解析を行うとともに、酸素消費速度を指標としたミトコンドリア機能解析を行う。
また、これまでの実験で用いているCARS2欠損マウスは全身性欠損マウスであり、心臓以外の組織におけるCARS2の関与を否定できない。そこで、アデノ随伴ウイルスベクターを用いて心筋細胞特異的にCARS2を過剰発現するマウスを作出し、CARS2欠損マウスで見られた虚血再灌流ストレスに対する予後変化がキャンセルされるかどうかを検証し、心臓組織におけるCARS2の重要性を示す。また、超硫黄分子ドナーを投与することによっても虚血再灌流ストレス後の予後変化をキャンセルできるかどうかを検証する。
CARS2は超硫黄分子合成酵素としてのみならず、システイニル転移RNA合成酵素としても機能するタンパク質であるが、これらの機能は異なるアミノ酸配列に依存していることが明らかになってきている。そこで、超硫黄分子合成に必要なアミノ酸配列を変異させたCARS2を用いて、超硫黄分子合成酵素としてのCARS2の重要性を示す。
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