2020 Fiscal Year Annual Research Report
試験管内再構成された環状ＤＮＡ複製サイクルにおける転写翻訳反応の共役
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19J20097
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| Research Institution | Rikkyo University |
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Principal Investigator |
奈良 聖亜 立教大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | ゲノム複製 / 自己複製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、試験管内で再構成した大腸菌ゲノム複製反応(RCR)と転写・翻訳反応(PURE system)を共役させることによって自己複製システムの構築を目指す。RCRは、25種のタンパク質を用いて大腸菌ゲノム複製システムを再構成した系であり、複製開始起点oriCを含む環状DNAを指数関数的に増幅する反応である。RCRとPURE systemの共役は、RCRに必要な複製タンパク質を遺伝子として有するoriC環状DNA(自己複製ゲノム)を鋳型に、PURE systemを用いて複製タンパク質を発現させ、さらに、発現した複製タンパク質を用いて鋳型となったoriC環状DNAの増幅を導くことで達成される。本年度では、RCRに含まれる複製タンパク質の1つ(複製開始タンパク質DnaA)について、この共役系の構築を行った。その過程で、同一鋳型DNA上で転写反応と複製反応が起こることによって、転写装置と複製装置が衝突を起こし、その結果、複製反応が阻害されてしまうという課題が明らかになった。生体内では、この衝突がゲノムの安定性を害することが知られ、また、この衝突を回避するシステムが存在することも明らかになっている。そこで、本研究における共役系に大腸菌の衝突回避システムを導入したところ、複製反応の阻害が解消され、DnaAの発現に依存した鋳型DNAの増幅が確認できた。これは生体内のシステムを手掛かりに新たなシステムを導入することで、自己複製システムの構築に向けた未知なる課題を解決できることを示した模範である。そしてその成果は、生命の基礎としての自己複製システムにおける新たな生物学的原理を明らかにすると期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度では、RCRに必要なタンパク質の1つについて、RCRとPURE systemの共役を行った。その過程で生じた複製と転写の衝突という課題を、大腸菌内のシステムを見本とすることで解決した。これは、研究課題達成に向けてはブレイクスルーとなる成果となっただけでなく、本研究のボトムアップ的再構成研究としての意義を示すことができた。これによって、最終年度に向けた基盤条件が確立できたと考え、おおむね順調に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の研究計画通り、RCRとPURE systemの共役系のエマルジョンを用いた区画化を行う。ここまでの共役系では、発現したタンパク質が反応液中に拡散して自身の鋳型DNA分子とは別分子を複製してしまうため、真の自己複製には至っていなかった。そこで、1分子ごとにエマルジョンに閉じ込めることで発現タンパク質と鋳型DNA分子を対応づけ、真の自己複製を目指す。この段階で、複製エラーによる遺伝子進化を観測できると考えている。これによって、より増幅に有利な変異が見つかることが期待される。最終的には、25種全てタンパク質について、その遺伝子を１つのoriC環状DNAにまとめあげた自己複製ゲノムを構築し、自己複製の振る舞いを観測する。
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Research Products
(4 results)
