2019 Fiscal Year Annual Research Report
非筋ミオシン活性の可視化と光操作による細胞分裂制御機構の解明
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19J20538
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| Research Institution | The Graduate University for Advanced Studies |
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Principal Investigator |
山本 啓 総合研究大学院大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | ミオシン / 光遺伝学 / 細胞骨格 / MYPT1 / イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
動物細胞における細胞質分裂の過程は、非筋ミオシンII（NMII）およびアクチンフィラメントが協働的に生み出す収縮力や張力といった、力学的制御に基づく形態変化を伴う。しかし、分裂過程の細胞における局所的な力の制御機構に関する知見は少なく、細胞質分裂の本質的な理解には至っていない。本研究は、細胞内において収縮力や張力の発生を担うNMIIの活性を光遺伝学的に操作する手法の開発、およびそれを用いた細胞質分裂や、細胞間での機械的相互作用の理解への応用を目的としている。
1.細胞内収縮力を操作する光遺伝学系の構築
NMIIは調節軽鎖のリン酸化により構造変化を起こし、アクチンフィラメントとの間で協働的に収縮力を生み出す。本研究では、NMII調節軽鎖（MLC）のホスファターゼに着目し、その制御サブユニットであるMYPT1を既存の光遺伝学の系と組み合わせて膜移行させることで、MLCの脱リン酸化およびそれに伴うNMIIの不活性化を試みた（Opto-MYPTシステム）。MYPT1のPP1結合ドメインのみを膜移行させることで、内在性のPP1の膜移行やそれに伴う細胞内局所的なMLCの脱リン酸化が可能であることを確認した。
2.アフリカツメガエル胚における光遺伝学の導入
脊椎動物の胚発生過程の中でも、特に神経管形成や上皮組織の収斂伸長において、アクトミオシンの生み出す収縮力は重要である。そこで、Opto-MYPTシステムの発生生物学的な応用を見据え、比較的観察が容易なアフリカツメガエル初期胚への本システムの導入を試みた。CSUを用いた高速3次元イメージングにより、CRY2-CIBやBcLOV4の系が培養細胞と同様に機能することを確認することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目的どおり、光遺伝学とミオシンホスファターゼを組み合わせることで、NMII活性を青色光照射下で不活性化する新規システムを構築することができた。さらに、細胞内局所的な光照射により、細胞形態の変化を誘導することにも成功した。また、本システムをアフリカツメガエル胚に適用することで、胚発生過程におけるアクトミオシンの力学的寄与を明らかにできる可能性が示唆された。以上の点から、本研究課題はおおむね順調に進展していると結論づけた。
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| Strategy for Future Research Activity |
新たに構築した光遺伝学システムの評価として、１）脱リン酸化能・基質特異性の評価、２）光照射下における直接的な力の測定、を重点的に進める。
１）脱リン酸化能・基質特異性の評価：免疫染色を中心に、光照射下でのMLCの脱リン酸化レベルを定量する。また、本システムで脱リン酸化を担うPP1c分子のターゲットが多岐に渡ることから、ERMファミリータンパクといった他のアクチン結合タンパクについてもリン酸化レベルを定量し、本システムの基質特異性の評価とする。
２）光照射下における直接的な力の測定：牽引力顕微鏡、原子間力顕微鏡を用いて直接的な収縮力、張力の測定を行い、光照射下においてどれくらい力が変化するか明らかにする。
以上を以て本システムの評価とし、完了次第、細胞質分裂過程における局所的な光照射やアフリカツメガエル胚における形態形成の光操作を試みる。
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