2019 Fiscal Year Annual Research Report
抗がん剤感受性を決定するアクチン動態の解析および新規治療標的の同定
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19J21096
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| Research Institution | Konan University |
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Principal Investigator |
杉本 渉 甲南大学, フロンティアサイエンス研究科, 特別研究員(DC1)
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2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | がん / cancer / アクチン / actin / p53 / DNA損傷 / DNA damage |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでの研究で、がん細胞における細胞外基質の硬質化が、細胞質アクチン線維の形成などを介したがん抑制遺伝子p53の活性変化を誘導し、がん細胞の抗がん剤感受性に大きく影響を与えることを見出してきた。また、p53の活性が低下した細胞を抗がん剤で処理した際に、細胞核内において、アクチンが強固なファイバー様の構造体を形成することも見出してきた。
この核内のアクチンの特徴的な構造体である核アクチンファイバーは、構造的な特徴や形成条件、形成意義についてほとんど明らかになっていない。核アクチンファイバーの形成が、抗がん剤感受性に関与していることも考えられるため、この構造体の詳細な構造解析や、形成条件を明らかにしていくことで、形成の制御が可能となれば、p53の活性が低下しているような悪性がんに対する抗がん剤治療の改善に繋がることが考えられる。
当研究室では、核アクチンファイバーの形成に関わる分子をいくつか同定しており、それらの分子がどのように構造体の形成や維持に関わっているのかについて、詳細な解析を進めている。また、電子顕微鏡を用いた微細構造解析やマイクロニードルを用いた核引っ張り実験を行うことで、クロマチン構造との位置関係や関係性、核アクチンファイバー形成核の物性評価、ならびに構造体結合分子の同定を行うことで、核アクチンファイバーの形成意義を明らかにする。これらの解析をもとに、核アクチンファイバーの形成制御を行うことで、根治が困難な悪性度の高いがん細胞に対しても有効な治療法の確立を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度は、核アクチンファイバーの物性評価として「TEMを用いた微細構造の解析ならびにクロマチン構造との位置関係の解明」と「核アクチンファイバー形成核の硬さの測定とアクチンファイバー結合分子の同定」を行った。
TEM（透過型電子顕微鏡）を用いた観察では、CLEM（光-電子相関顕微鏡）法を用いて、核アクチンファイバーが形成している細胞核の観察を行なった。バッファー条件などを変え、幾度かの条件検討を行うことで、アクチンファイバーの染色に成功しており、核アクチンファイバーの構造的特徴の一端を明らかにすることができた。
核アクチンファイバー形成核の硬さの測定では、核に直接マイクロニードルを差し込むことで解析を行った。単離核を用いて硬さの測定を行う予定であったが、単離核では、核アクチンファイバー構造の崩壊やアクチン可視化プローブが流出することにより、測定が困難であった。これらの問題に関しては、生細胞を用いることで測定を行うことができた。アクチン可視化プローブであるChromobody-EGFPと共に、ヒストンH2B-mcherryを細胞内で発現させ、マイクロニードルを用いて核引っ張り実験を行うと、核アクチンファイバーの動きに応じてヒストンやDNAも同様に引っ張られるような現象が確認された。これにより、核アクチンファイバーは直接的、もしくは間接的にDNAやヒストンに結合している可能性があるという、新たな知見を得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究で、TEMを用いた核アクチンファイバーの観察に成功したため、核アクチンファイバーが分岐構造を有すること、ならびに太さが約200 nm程度あり、F-actinが束化されてできている構造体であることを新たに見出すことができた。そこで今後は、FIB-SEMを用いた三次元での構造解析を行うことによって、核アクチンファイバーのより詳細な構造解析、ならびに近傍に存在するクロマチンなどとの三次元的な位置関係について明らかにすることで、核アクチンファイバーの形成意義についても検討していく。染色条件については、すでに予備実験で染色に成功しているため、問題なく遂行できると考えられる。
マイクロニードルを用いた核の物性評価においては、生細胞を用いて実験を行うことに成功している。しかしながら、この測定方法では、細胞質の硬さも含めた計測になることから、核の硬さのみを反映した数値を算出する方法について、より詳細に検討を行い、核アクチンファイバー形成核の硬さの変化について明らかにしていく。生細胞での測定が困難であれば、単離核を用いた実験において、単離や測定の際のバッファー条件を見直し、核アクチンファイバー構造が崩壊しないような条件下で測定を試みる。また、核を引っ張る実験においては、核アクチンファイバーを引っ張るとヒストンやDNAも同様に引っ張られることが確認されたため、結合していることが示唆された。そこで今後は、DNA修復や転写などに関わる分子が核アクチンファイバー構造とどのように関わっているのかを明らかにし、核アクチンファイバーの形成意義について検討を行っていく。
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[Journal Article] DMPK is a New Candidate Mediator of Tumor Suppressor p53-Dependent Cell Death2019
Author(s)
Katsuhiko Itoh, Takahiro Ebata, Hiroaki Hirata, Takeru Torii, Wataru Sugimoto, Keigo Onodera, Wataru Nakajima, Ikuno Uehara, Daisuke Okuzaki, Shota Yamauchi, Yemima Budirahardja, Takahito Nishikata, Nobuyuki Tanaka, and Keiko Kawauchi
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Journal Title
Molecules
Volume: 24(17)
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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