ＲＮＡテクノロジーを基盤としたヒト造血幹細胞選別技術の開発

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19J21199
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 小野 紘貴 京都大学, 医学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2019-04-25 – 2022-03-31
• Keywords: miRNA / miRNAスイッチ / 造血幹細胞 / 翻訳制御 / 合成生物学

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、細胞内在性のマーカー分子に基づいた新たな造血幹細胞選別手法を開発する。
遺伝子の転写後発現制御を担う短いnon-coding RNAであるマイクロRNA (miRNA) は、近年細胞種のマーカーとなることが明らかになってきた。申請者はこのmiRNAに着目し、miRNAの活性に基づいて造血幹細胞の細分化を試みた。まず、蛍光レポータータンパク質をコードするmRNAの5’-UTRにmiRNAの標的配列を挿入した人工mRNAであるmiRNAスイッチを作製した。このmRNAの翻訳は、miRNA活性を有する細胞内では抑制されるが、活性を持たない細胞の中では抑制を受けない。miRNAスイッチにコードされる蛍光レポータータンパク質の発現強度はmiRNAの活性を反映しており、レポーターのシグナルの強弱に基づいてmiRNA活性の低いあるいは高い細胞を識別することが可能である。ある種のmiRNAに応答するmiRNAスイッチを、生体外で増幅したマウス骨髄由来造血幹細胞に導入し、レポーターの発現量をフローサイトメトリーにより定量したところ、そのような細胞の中にはレポーターの発現が強く抑制されるmiRNA活性の高い細胞と、レポーターの発現が抑制されないmiRNA活性の低い (ない) 細胞が混在しており、このmiRNAの活性が不均一であることが分かった。さらに、いくつかのmiRNAに応答するmiRNAスイッチを作製し、生体外で増幅したマウス骨髄由来造血幹細胞に導入したところ、複数のmiRNAの活性に不均一さが見られた。この結果は、miRNA活性に基づいて造血幹細胞を細分化できる可能性を示唆している。今後は、miRNA活性に基づいて識別される細胞の性質を評価するために、放射線照射したマウスへの移植アッセイを実施する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、(1) 造血幹細胞特異的な細胞内因子に応答して翻訳が制御されるmRNAスイッチの作製とその機能検証、(2) 標的細胞への効率的なmRNAスイッチの導入方法の確立、(3) mRNAスイッチで選別された細胞の機能評価、の3つの課題を設定していた。これらの課題のうち、(1) 造血幹細胞特異的な細胞内因子に応答して翻訳が制御されるmRNAスイッチの作製とその機能検証については、造血幹細胞の指標になり得ると考えられる候補miRNAを複数同定済みであり、それらに応答するスイッチを作製して細胞内での挙動も確認済みである。従って、当初の目標をほとんど達成できている。
(2) 標的細胞への効率的なmRNAスイッチの導入方法の確立については、マウス骨髄から採取した造血幹細胞に対して、エレクトロポレーション法を用いることにより顕著な細胞毒性なく、100％に近い効率でmRNAを導入することに成功しており、当初の目標は概ね達成済みである。今後はヒト臍帯血由来細胞に対しても、高い導入効率と細胞生存率を達成できる条件を探索していく予定である。
(3) mRNAスイッチで選別された細胞の機能評価については、課題 (1) で造血幹細胞において活性が不均一なmiRNAを複数同定しており、今年度はこれらのmiRNAに基づいて分取した細胞の機能評価を行う予定である。
以上のことから、本研究の進捗状況は「おおむね順調に進展している」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

これまでの研究で、造血幹細胞においてある種のmiRNA活性が不均一であることが明らかになった。そこで、本年度はmiRNAを指標として分取された細胞の機能評価を実施する。具体的には、造血幹細胞特異的なmiRNAに応答するmiRNAスイッチを、造血幹細胞を含む細胞分画に導入し、スイッチから発現するレポータータンパク質のシグナル強度に基づいて細胞をソーティングする。そして、得られた分画に造血幹細胞が含まれているかどうかを検証するために、ソートした細胞を放射線照射により造血機能を破壊したマウスに移植する。ドナー細胞由来の成熟血液細胞が末梢血中に産生されているかどうかを移植後数ヶ月にわたって解析することにより、ドナー細胞が多分化能と自己複製能を備えた造血幹細胞であったかどうかを評価することができる。また、限界希釈法を用いて、ソートした細胞中の造血幹細胞の頻度を推定し、miRNA活性に基づいて造血幹細胞を濃縮することが可能であるかどうかを検証する。さらに、miRNA活性を指標にヒト造血幹細胞を高純度濃縮することが可能かどうかについても検証する。造血幹細胞を多く含むヒト臍帯血由来の細胞にmiRNAスイッチを導入し、miRNA活性に基づいて細胞をソートする。そして、miRNA活性をもとに選別した細胞の機能評価を行うために、ソートした細胞を放射線照射した免疫不全マウスに移植し、移植後数ヶ月にわたって末梢血の解析を行う。