2019 Fiscal Year Annual Research Report

超好熱性アーキア膜脂質の生合成による大腸菌細胞膜の強化

Research Project

Project/Area Number	19J21282
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	吉田稜名古屋大学, 生命農学研究科, 特別研究員(DC1)
Project Period (FY)	2019-04-25 – 2022-03-31
Keywords	アーキア / 細胞膜 / イソプレノイド / メバロン酸経路 / 大腸菌 / 極限環境生物 / メタボリックエンジアリング / 合成生物学
Outline of Annual Research Achievements	超好熱性アーキア膜脂質の生産による大腸菌細胞膜の強化、及びそれを応用した高効率の疎水性バイオ燃料や化成品などの有用物質生産システムの構築を目指した。既に超好熱性アーキア膜脂質の一つであるC25アーキア膜脂質の大腸菌での合成システムは確立できているものの、その生産量は低く、同脂質の生産による大腸菌への影響は確認できていない。そこでアーキア膜脂質の合成量向上を目指し、同脂質のイソプレノイド部の生合成前駆体合成経路の一つであるアーキア型メバロン酸経路を常温性メタン生成アーキアMethanosarcina mazeiから単離した。簡便に大腸菌でのイソプレノイド生産能を検証するため、赤色色素のリコペン生産経路とともに同経路を大腸菌に導入した結果、準嫌気的条件においてリコペンの生産量が大幅に向上した。これにより大腸菌でのC25アーキア膜脂質の合成量向上が期待できる。また還元型アーキア膜脂質の大腸菌での生産には準嫌気的条件が必要であるが、そのような培養条件でイソプレノイド生産の増強に成功したため、これまで困難であると考えられていた還元型アーキア膜脂質の大量生産に取り組むことが可能となった。これに加えて、C25アーキア膜脂質のイソプレノイド鎖よりも長いC30やC35のイソプレノイド鎖を持つ非天然型のアーキア膜脂質の合成にも取り組んだ。様々な生物由来のプレニル二リン酸合成酵素、プレニル基転移酵素を用いてin vitroでC30またはC35のイソプレノイド鎖をもつアーキア膜脂質の合成を試みた。その結果、C30のイソプレノイド鎖を持つアーキア膜脂質の合成に成功した。同脂質も大腸菌細胞膜の強化に繋がると考え、合成経路を大腸菌内で構築し、同脂質の大腸菌での生産を行った。今後は同脂質の合成量向上によりその生産が与える大腸菌への影響を観察していきたい。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の計画通り、大腸菌へのアーキア型メバロン酸経路の導入を行った。その結果、準嫌気的条件で赤色カロテノイドの合成量の大幅な向上が見られた。これによってC25アーキア膜脂質の合成量向上が期待できる。特に還元型アーキア膜脂質の大腸菌生産に必要であった準嫌気的条件でのイソプレノイド生産向上を達成したことは大きな成果である。また、並行してC30またはC35のイソプレノイド鎖を持つ非天然型アーキア膜脂質の合成に取り組み、C30イソプレノイド鎖を持つアーキア膜脂質の合成に成功した。アーキア膜脂質のイソプレノイド鎖の伸長は細胞膜のバリアー機能の強化に繋がり、C30イソプレノイド鎖を持つ非天然型アーキア膜脂質はC25アーキア膜脂質よりも大腸菌細胞膜強化に効果を示す可能性がある。同脂質の大腸菌での合成量を増加させることで大腸菌の細胞膜の強化が見られることを期待したい。
Strategy for Future Research Activity	まずは、アーキア型メバロン酸経路を導入した大腸菌株に非還元型C25アーキア膜脂質合成経路を導入し、同脂質の大量合成を目指す。非還元型C25アーキア膜脂質は好気条件での培養でも生産が可能であるため、もしアーキア型メバロン酸経路の導入による効果が十分でない場合、大腸菌が本来持つイソプレノイド合成経路であるメチルエリスリトールリン酸経路の強化に取り組む。次に、還元型C25アーキア膜脂質の合成経路をアーキア型メバロン酸経路導入株に導入する。同脂質の合成量が十分増加しない場合、用いるプラスミドやプロモーターを変更するなどしてC25アーキア膜脂質合成経路、及びアーキア型メバロン酸経路の最適化を行う。非天然アーキア膜脂質についてもアーキア型メバロン酸経路の導入によって、その大腸菌での合成量の向上に取り組む。これらを通して大腸菌でのアーキア膜脂質の大量合成が達成できた場合、同株の有機溶媒耐性、細胞膜の性質などを検証していく。