自然宿主コウモリにおけるレオウイルスの特異的な複製制御機構の解明

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19J21852
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 納田 遼太郎 大阪大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2019-04-25 – 2022-03-31
• Keywords: 自然宿主 / コウモリ / レオウイルス / 複製制御

Outline of Annual Research Achievements

1. PRV-p17とBroV-因子Aの相互作用の解析
PRV-p17はPRVがもつ因子Aの活性をコウモリ細胞特異的に活性化し、複製効率を制御していることが分かっている。本年度は、他の近縁なウイルスの因子Aのクローニングを行い、p17と因子Aとの相互作用について解析を行った。通常、コウモリ細胞に因子Aを単独で発現させると、因子Aは機能しない。しかしながら、PRVに近縁なBroome virus (BroV)の因子Aは活性が低いものの、一定の活性をコウモリ細胞において単独発現時にも示すことが分かった。またBroV-因子AはPRV-p17との共発現によって、より高い活性を示すこともわかった。これらの結果から申請者は、BroV-因子Aの特定の領域がp17非存在下における活性の保持に寄与していると考えた。そのようなBroV-因子Aの特定の領域を同定するため、申請者はBroV-因子Aの変異体発現ベクターを複数作製し、p17の存在下/非存在下における活性を解析した。その結果、C末端の40-50アミノ酸を欠失したBroV-因子Aの活性が、単独発現時に著しく低下することが分かった。さらに、PRV-p17と共発現することで、機能が回復することが分かった。以上の結果より、PRV-p17はPRV-因子AやBroV-因子AのC末端領域に作用し、因子Aの活性化を行っていることが示唆された。今後は、因子AのC末端とp17の相互作用について解析を進め、本研究課題を進展させる。

2. p17と相互作用する宿主因子の探索
p17発現時、非発現時における転写産物の変化をRNA-seqを用いて解析を行った。また、免疫沈降法を用いて、p17と相互作用する因子の探索も行った。現在、複数の候補因子が同定されており、対象遺伝子のクローニング、プラスミドによる過剰発現系の構築、ノックダウン細胞の作製など引き続き詳細な解析を行う。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画通り、p17と因子Aの相互作用を詳細に解析することができている。今後は、これら2つのウイルス性因子と相互作用する宿主因子の同定を行い、本研究課題を進展させる。

Strategy for Future Research Activity

現在、PRVやPRVに近縁なウイルスのp17相同体、因子A発現ベクターを複数作製している。p17、因子Aと相互作用する宿主因子の同定を行うため、これらのベクターを様々な条件でコウモリ細胞に導入し、その時のRNAトランスクリプトームや発現タンパク質の変化などに着目し、宿主因子の同定を行う。

Research Products

• [Journal Article] Generation of recombinant rotaviruses encoding a split NanoLuc peptide tag (2021)
  • Author(s): Pannacha P, Kanai Y, Kawagishi T, Nouda R, Nurdin JA, Yamasaki M, Nomura K, Lusiany T, Kobayashi T
  • Journal Title: Biochemical and biophysical research communications Volume: 534 Pages: 740-746
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.11.007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Generation of Genetically RGD σ1-Modified Oncolytic Reovirus That Enhances JAM-A-Independent Infection of Tumor Cells (2020)
  • Author(s): Kawagishi T, Kanai Y, Nouda R, Fukui I, Nurdin JA, Matsuura Y, Kobayashi T
  • Journal Title: Journal of virology Volume: 94 Pages: e01703-20
  • DOI: 10.1128/JVI.01703-20
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Reverse Genetics Approach for Developing Rotavirus Vaccine Candidates Carrying VP4 and VP7 Genes Cloned from Clinical Isolates of Human Rotavirus (2020)
  • Author(s): Kanai Y, Onishi M, Kawagishi T, Pannacha P, Nurdin JA, Nouda R, Yamasaki M, Lusiany T, Khamrin P, Okitsu S, Hayakawa S, Ebina H, Ushijima H, Kobayashi T
  • Journal Title: Journal of virology Volume: 95 Pages: e01374-20
  • DOI: 10.1128/JVI.01374-20
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] Nelson Bay orthoreovirus p17 protein regulates viral replication in a host-specific manner (2020)
  • Author(s): Ryotaro Nouda
  • Organizer: American Society for Virology
  • Int'l Joint Research