2020 Fiscal Year Annual Research Report
人工金属錯体を有するヘム酵素の開発および高難度酸化反応の達成
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19J21931
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
大村 慧太 名古屋大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | シトクロムP450 / 酸化反応 / ヘム置換 / バイオ触媒 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，水酸化酵素であるシトクロムP450BM3に対し，補因子であるヘムを他の錯体に置換することで，新規反応性の開拓および高難度酸化反応の高効率化を目指した．これまでの検討により，マンガンプロトポルフィリンIX（Mn-PPIX）結合型P450BM3（Mn-BM3）が酸素分子の活性化，および，基質のC(sp3)-H結合の水酸化反応を行うことを見出した．
本年度は，その酸素分子活性化，および，基質の酸化過程について詳細な検討を行った．通常，シトクロムP450の酸化活性種（Compound I）の生成には，酸素分子の還元的活性化が必要であり，P450BM3では還元ドメインが電子伝達を担い，効率的な還元的活性化を行う．一方，ヘム以外のポルフィリン錯体を導入したシトクロムP450の酸化活性種の生成過程に関しては詳細な知見が得られていない．そこで，本研究で調製したMn-BM3を用い，その反応サイクルにおける電子伝達について検討を行った．Mn-BM3に対し，生物学的還元剤であるNADPHを加えたところ，還元ドメインの補欠分子であるFMNから活性中心のMn-PPIXへの電子伝達が観測された．この結果は，非天然の金属錯体であるMn-PPIXであっても，還元ドメインを経由した電子伝達が行われ，ヘム結合型P450BM3と同様に酸素分子の還元が行われるという想定反応機構を支持するものである．続いて，酸化活性種によるC(sp3)-H結合の水酸化機構を調べるため，シクロプロパン骨格を有する基質を用いた検討を行った．Mn-BM3との反応後にシクロプロパン環が開環した生成物が観測されことから，Mn-BM3の水酸化反応の反応中間体としてアルキルラジカルが生じていることが示唆された．すなわちMn-BM3は，ヘム結合型P450BM3と同様に「水素原子引抜き/OH再結合」機構でC(sp3)-H結合の水酸化を行うことが示唆された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ストップトフローを利用した高速反応過程の観測実験により，還元ドメインの補欠分子であるFMNから非天然ポルフィリン錯体であるマンガンプロトポルフィリンIX（Mn-PPIX）への電子伝達の観測に成功した．それに加え，還元型Mn-PPIXと酸素分子の結合過程の観測にも成功している．さらに，ラジカルクロックと密度汎関数法（DFT）を用いた検討により，酸化活性種による基質の酸化機構に関する知見が得られた．以上の通り，酸素分子の活性化過程および基質の水酸化に関する詳細なメカニズムが明らかとなり，これらの成果は今後の触媒の設計に大きく貢献するものと考えられる．さらに，先行研究で開発された，P450BM3の基質特異性改変手法を利用することにより，多様な有機小分子に対して酸化活性を示すことも確認されている．以上の通り，高難度酸化反応の達成に向けて着実に成果が得られており，当初の計画通りに研究が進行したといえる．
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの検討から，酸素分子の活性化過程が全体の触媒効率に大きく影響していることが示唆されている．そこで高効率な触媒の調製には，酸素分子の活性化効率を向上させることが必要だと予想される．したがって，今後は酸素分子の効率的な活性化に向けた検討を行う．これまでの検討から，鉄プロトポルフィリンIX（ヘム）とマンガンプロトポルフィリンIX（Mn-PPIX）を用いた場合に酸素分子の活性化を行うのに対し，他のポルフィリン錯体では酸素分子の活性化が効率的に進行しないという結果が得られている．今後，酸素分子の活性化を行うポルフィリン錯体の設計に関して，各種検討を通じて具体的な指針が得ることによって，高活性な触媒の創出が可能になると期待される．酸素分子の活性化は中心金属の還元，酸素分子との結合，結合した酸素分子のプロトン化といった複数の反応から構成される複雑な過程となっており，各過程の反応速度の測定および，各反応中間種の同定を行うことにより，詳細な議論が可能となる．酸素分子の活性化が可能なポルフィリン錯体と，活性を示さないポルフィリン錯体を比較検討し，酸素分子の活性化を促進する構造的・電子的要因を解明し，高活性な触媒の創出を目指す．
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Research Products
(2 results)
