2019 Fiscal Year Annual Research Report
新奇な構造を持つSOD遺伝子のドーパミン生合成の制御メカニズムの解明
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19J21971
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
西子 まあや 東京農工大学, 大学院連合農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | スーパーオキシドディスムターゼ / 昆虫生理学 / RNA干渉 / 定量RT-PCR / RNA-seq / トランスクリプトーム / コクヌストモドキ / Tribolium castaneum |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、コクヌストモドキ成虫期におけるRNAiによる卵への影響の検討(Parental RNAi)、凍結切片を用いた免疫染色および共焦点レーザー顕微鏡による観察、ダイヤモンド切片を用いたTEMによる観察、コクヌストモドキ脚の骨格構造の染色による腱の構造の観察、さらに、次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析といった、新しい方法による実験を実施し、それにより、今まで明らかにできていなかった数多くの結果を得ることが出来た。
１）Parental RNAiによるTcSOD6遺伝子ノックダウンでは、TcSOD6は生殖機能もしくは胚発生においても、重要な役割を持つことが、新たに明らかとなった。
２）共焦点レーザー顕微鏡および、TEMによる切片の観察では、TcSOD6を遺伝子ノックダウンした蛹5日目の個体とコントロールでは、キチン、アクチン、ヌクレアーゼそれぞれの局在と、微細構造に差異は認められないことが明らかとなった。
３）TcSOD6遺伝子ノックダウンによって脚の運動が異常となった個体の、骨格(キチン質)を染色することで、運動に異常を示した脚の腱の構造はコントロールと差異がなく、異常な運動の原因は腱の構造的な欠陥ではないことが明らかとなった。
４）TcSOD6をノックダウンした個体とコントロールの蛹4日目での遺伝子転写産物を比較し、発現変動遺伝子を決定したところ、軸索伸張に関連する機能を持つ遺伝子が多く発現上昇したことが明らかとなった。
これらの結果は、Eighth International Symposium on Molecular Insect Science、International workshop on Insect Cuticular Extracellular Matrix、第5回蚕糸・昆虫機能利用関東地区学術講演会において発表し、高い評価を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、定量RT-PCRによる各発育ステージにおけるTcSOD6のmRNA発現様式の検討、RNA干渉による各発育ステージにおけるTcSOD6の機能の検討、共焦点レーザー顕微鏡およびTEMを用いた微細構造の観察によるTcSOD6遺伝子ノックダウンにおける表現型の解析、次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析によるTcSOD6遺伝子ノックダウンにおける遺伝子発現変動の解析を行った。
具体的には、定量PCRによるmRNA発現の解析によって、胚の時期および蛹の後期で発現量が上昇することが明らかとなった。RNA干渉によってTcSOD6を遺伝子ノックダウンすると、遺伝子ノックダウンを行う発育ステージによって2つの表現型が観察された。幼虫期、前蛹期、および蛹期でTcSOD6の遺伝子ノックダウンを行うと、成虫期での寿命が短くなり、脂肪体が減少し、脚の動きが異常となる表現型が観察された。一方、性成熟した成虫のメスにTcSOD6の遺伝子ノックダウンを行うと、産卵した卵の孵化率が著しく低下した。これらのことから、TcSOD6は蛹期に高い発現を示し、成虫期の寿命および脚の動きを制御していること、成虫期および胚での発現は高くない一方で、胚の時期にも重要な機能を有し、孵化率を制御することが明らかとなった。さらに、TcSOD6を遺伝子ノックダウンした個体を用いたトランスクリプトーム解析では、コントロールと比較して、軸索伸長に関わる機能を持った遺伝子群の発現が上昇していた。
これらにより、コクヌストモドキ各ステージにおけるTcSOD6の機能や、TcSOD6が関与する生物学的イベント、発現を制御する遺伝子群を明らかとし、TcTHを介した神経伝達系を含む、昆虫運動神経系におけるTcSOD6の役割を考察することが出来たため、本研究課題の進捗はおおむね順調であると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究により、コクヌストモドキ前蛹、幼虫、蛹の時期において、TcSOD6の遺伝子ノックダウンを行うと、成虫期での脚の運動が異常になることが分かった。従って、成虫期の脚の運動におけるTcSOD6の機能を解析するために、昆虫の動きを制御するドパミンの生合成系に関与する、TcTHを含む分子や、その他の脳内伝達物質との結合を検討する。具体的には、TcSOD6の発現部位および結合分子を検討するために、TcSOD6タンパク質に対する抗体を作成し、蛍光免疫染色によってタンパク質の発現部位を確認し、TcTHを含めた他の分子との局在を比較し、免疫組織化学によって分子同士の結合を確認する。
また、トランスクリプトームによる遺伝子発現の網羅的な解析により、TcSOD6は変態中の軸索伸長に関与することが示唆された。そこで、RNA干渉によってTcSOD6を遺伝子ノックダウンし、免疫染色法を用いて神経を染色し、コントロールと比較する。これにより、トランスクリプトーム解析により得られた結果を裏付け、TcSOD6遺伝子ノックダウンによる脚の運動異常の原因を、神経形成異常の観点から検討する。
さらに、TcSOD6のmRNA発現量が、幼虫期や成虫期に比べて胚の時期で増加したことや、性成熟したメスを用いたTcSOD6遺伝子ノックダウンでは、卵の孵化率の低下が観察されたことから、TcSOD6は胚の時期に機能を持ち、孵化率を制御することが示唆された。よって、TcSOD6が卵の孵化率を制御する仕組みを考察する。性成熟したメスに対してTcSOD6遺伝子の発現をRNA干渉により抑制し、産下された卵を用いてトランスクリプトーム解析を行い、コントロールと比較して遺伝子発現変動を網羅的に解析する。この結果から、TcSOD6が関与する生体内のイベントを予測し、そのイベントに関わる分子とTcSOD6との関係を検討する。
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