2019 Fiscal Year Annual Research Report
Cav3．2リン酸化修飾経路の同定・摂動による入眠行動の分子基盤探求
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19J22074
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
昆 一弘 東京大学, 大学院医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | 睡眠 / カルシウムチャネル / リン酸化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
入眠は覚醒から睡眠という行動学・生理学的に相互排他的な状態変化を担う行動であり、その制御は個体の適切な睡眠覚醒のために必要不可欠である。本研究では、入眠に重要な分子であるCav3.2の大規模機能解析系と質量分析によるリン酸化解析からCav3.2リン酸化修飾経路を同定し、その経路を摂動した遺伝子改変マウスの作製およびその睡眠表現型解析から、Cav3.2のリン酸化修飾による機能制御が入眠過程に重要であるという仮説を検証することを目的とする。
はじめに、睡眠覚醒に関与し得るキナーゼについて恒常活性およびリン酸化活性欠損変異体発現ベクターを作製し、in vitro大規模Cav3.2機能解析系を用いてCav3.2機能を制御し得るキナーゼを探索した。その結果、複数のキナーゼの恒常活性変異体においてCav3.2機能が亢進もしくは抑制され、この効果はリン酸化活性欠損変異を導入することによってキャンセルされた。これはリン酸化修飾によりCav3.2機能が制御されていることを示唆する。次に、Cav3.2の細胞内ループドメインにあるセリン・スレオニンをアラニンに置換したCav3.2アラニン変異体を作製し、キナーゼ恒常活性変異体の効果をキャンセルするリン酸化修飾部位を探索した。その結果、一部のキナーゼに関しては特定の細胞内ループドメインが標的であることが示唆された。最後に、自動断眠装置を作製し、マウスを恒常的に断眠する手法を開発した。回復睡眠の測定から、自動断眠装置による断眠効果は従来の断眠方法と比べても遜色ないことが示された。この方法を用いることで、従来よりも簡便に複数マウスの長時間断眠を行うことが可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Cav3.2の大規模機能解析系では、Kir2.3を共発現させることが鍵となるが、Kir2.3の過剰発現による細胞毒性が問題になる場面があった。そこで、Kir2.3恒常発現細胞株の選別を行い、Cav3.2機能を解析するのに最適な発現量の細胞株を確立した。この細胞株を用いたCav3.2の機能解析により、新規に複数のCav3.2機能を制御しうるキナーゼを発見した。さらに、遺伝子合成を用いてCav3.2の細胞内ドメインにあるセリン・スレオニンを複数個同時にアラニンに置換した変異体を作製し、責任リン酸化修飾部位をドメインごと探索することで、キナーゼの効果をキャンセルするドメインを発見するに至った。特定残基のリン酸化修飾がCav3.2の分子特性を変化させることが示唆され、個体を用いた入眠におけるCav3.2機能制御の重要性を確かめるための実験につながる結果を得たことから、研究はおおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
キナーゼの標的部位のさらなる絞り込み行い、そのリン酸化修飾部位をアラニンまたはアスパラギン酸に置換したCav3.2変異マウスを作製し、その睡眠表現型を解析する。加えて、キナーゼのノックアウトマウスを作製し、その睡眠表現型を解析する。これらのマウスが胚性致死や発生異常を呈する可能性も考慮し、AAVベクターを用いた成獣における遺伝子操作の準備も並行して進める。
また、作製した自動断眠装置を用いてマウスの長時間断眠を行い、その際のリン酸化レベルを定量し、生理的な入眠条件下でのCav3.2リン酸化修飾の重要性を検証する。
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[Presentation] CUBIC-Cloud: A point-cloud-based computational framework to analyze, visualize and share data for whole brain profiling by tissue clearing2020
Author(s)
Mano T, Susaki EA, Murata K, Kon K, Shimizu C, Ono H, Shi S, Yamada RG, Miyamichi K, Touhara K, and Ueda HR
Organizer
5th Symposium of Integrated analysis and regulation of cellular diversity
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