2019 Fiscal Year Annual Research Report
一細胞計測と光遺伝子操作を利用した遺伝型-表現型対応の履歴依存性の理解
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19J22506
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小金澤 優太 東京大学, 総合文化研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | 一細胞計測 / 光遺伝学 / 遺伝型-表現型対応 / 薬剤耐性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2019年度では主にクロラムフェニコール(以下Cp)環境下で耐性遺伝子を除去しても分裂を続ける機構を明らかにするために、1. Cp投与とCp耐性遺伝子(cat遺伝子)除去のタイミング依存的なCp耐性の維持の観察、2. デバイスから回収した細胞の全ゲノムシーケンス、3. ribosome発現レポーター株を用いた耐性遺伝子除去実験の3つを行った。
1.について、申請時の研究結果ではCp環境下でcat遺伝子を除去した大腸菌のうち40%程度が安定にCp環境下で成長、分裂すること確認していた。一方で、予めcat遺伝子を持たない細胞では同濃度のCpで全ての細胞が分裂できなかった。そこで、cat遺伝子を除去してからCpを投与するタイミングを、遺伝子除去を0時間として0~10時間の間で変化させたところ、分裂する細胞は時間依存的に減少し10時間後には全ての細胞で分裂を停止することを確認した。この結果は遺伝型-表現型の対応関係が環境変化の履歴に依存していることを示唆している。
2.について、変異が入っていないことを確認するため、Cp環境下でcat遺伝子を失った細胞をデバイスの廃液から取り出した。取り出した細胞がmcherry-catを失っていることを確認し、さらにこれらの細胞に対して全ゲノムシーケンスを行なったところ、耐性を上昇させるような変異は確認されなかった。このことから、Cp環境下でcat遺伝子を失った細胞が分裂を継続できるのは耐性に寄与する変異獲得によるものだけではないことがわかった。
3.について、Cpのターゲットであるribosomeの発現変動を明らかにするため、cat遺伝子を除去できるribosomeの発現レポーターを作製、観察したところ耐性遺伝子の除去によってribosomeタンパク質の発現バランスが崩れた。さらに分裂を続ける細胞ではこのバランスが分裂、成長の回復と共に再度回復することが確認された。このことから、ribosomeのバランスがCp環境での耐性表現型の維持に関与していることが予想される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の目的の一つであったCp耐性遺伝子を失ってもなお分裂を続ける機構の解明についてribosomeレポーター株を作製し、ribosomeの単純な発現量ではなくribosomeタンパク質ごとのバランスが肝要であることを見出せたことはこの研究において来年度以降にも繋がる大きな進展となった。また、本研究の中で困難であると考えていたデバイスからの細胞の取得について、Cp環境から一度薬剤のない状態に戻してからという限定的な条件ではあるが成功した。この方法で取得した細胞に対して全ゲノムシーケンスを行ったことで、これまでこの研究に対して出されていた「突然変異による耐性の獲得ではないのか」という疑問に対して、突然変異による耐性の獲得ではないということが明らかにできたという点もとても重要であった。
一方で、この方法ではデバイスから取得した細胞からトランスクリプトーム解析を行っても環境が変化してしまっているため結果の解釈が困難であるため、発現の変動をトランスクリプトーム解析を使って行うことは難しくなったため、来年度以降では異なる方法で発現変動を追う必要が生じてくる。また、観察で取得される顕微鏡画像の解析について画像処理、解析の自動化を目指しているが、現在のところ、深層学習を用いた画像解析手法などを使用してみたものの、完全な自動での画像処理、解析は困難であり、マニュアルによる修正が必要となっている。
以上の点を総合的に考慮して、現在の研究の進捗はおおむね順調に進行していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在の研究の進捗状況の欄にも記したように、現在の手法ではCp耐性遺伝子を失ってもなおCp環境下で分裂を続ける細胞のトランスクリプトーム解析を行うことは困難である。また、この分裂を続ける細胞はribosomeタンパク質の発現量が変化している。この2点を踏まえて、まずは細胞内のppGppと呼ばれる小分子の量をモニターする。ppGppはribosomeの発現を制御しているだけではなく、グローバルな細胞内の遺伝子制御因子であることが知られているためppGppの変動を追うことでトランスクリプトーム解析で観察する予定であった多くの遺伝子の発現変動を推定できるのではないかと考えている。
また、本研究の目的の一つである、遺伝型-表現型の履歴依存性の普遍性を明らかにするために、まずはストレプトマイシン、カナマイシン、アンピシリンといったCp以外の薬剤、あるいは薬剤耐性遺伝子を用いて同様の遺伝子除去実験、解析を行う。ここから薬剤、あるいは耐性遺伝子の種類によって履歴依存性がどのように変化するかを明らかにすることを目指す。
さらに、顕微鏡画像の処理、解析の自動化については、本研究で用いているデバイスMother Machineのために作られた深層学習を用いた画像処理プログラムもいくつか報告されるようになったため、それらを本実験に合うように利用することを行いつつ、同時にマニュアル部分の高速化のため、タブレットを導入して、画像処理のさらなる高速化を目指す予定である。
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