2020 Fiscal Year Annual Research Report
ニワトリｆｏｘｌ３遺伝子の解析から探る，鳥類特有の性分化機構
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19J22544
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
市川 健之助 広島大学, 統合生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | 性分化 / 始原生殖細胞 / ニワトリ / foxl3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では, 鳥類特有の性分化機構を明らかにすることを最終目標としている. そのために, メダカ生殖細胞の性決定機構に関与するfoxl3遺伝子に着目し, 鳥類生殖細胞の性決定機構の解明を目的とした解析を行う.
これまでの研究成果から, ニワトリFOXL3-like proteinは, 生殖細胞の性決定機構に関与するfoxl3と異なる発現パターンをもつことが明らかになった. そこで, 令和2年度では, foxl3に代わって性決定を担う, 鳥類特有の性決定機構の探索を目的とした解析を行なった. 本解析では, 孵卵2.5, 4.5, および6.5日胚から単離した雌雄の始原生殖細胞をRNA-seq解析に供試し, 遺伝子発現プロファイルの変動を明らかにした. その結果, ニワトリ始原生殖細胞は, メス先駆的に性決定を生じることが予測された. 加えて, W染色体上の因子を介した新規の性決定機構の存在が示唆された. 続いて, RNA-seqの解析結果の妥当性を評価するために, メス由来始原生殖細胞に特異的な因子を標的とし, RT-qPCRを用いた発現解析を行なった. その結果, RNA-seqと同等の発現パターンがRT-qPCRにおいても再現された. 本成果は, 第44回鳥類内分泌研究会において発表し, その成果が認められ, 同大会において若手研究員奨励賞を受賞するに至った. 加えて, 培養細胞を用いた刺激試験においても本仮説を裏付ける成果を得ており, foxl3の上流における鳥類特有の生殖細胞の性決定機構が明らかにされつつある.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和2年度は, (1)foxl3の上流において, 始原生殖細胞のメス化を誘導する新規機構の解明, および(2)foxl3-like proteinの機能解析を当初の計画としていた. (1)では, RNA-seq解析により, 過去に報告例のない,W染色体上の因子を介した, メス先駆的な始原生殖細胞の性決定機構が予測された. そのため, 鳥類特有の生殖細胞の性決定機構の解明する上で, 期待を上回る成果を得られたと考えられる. その一方で, (2)はメス由来始原生殖細胞の安定的な培養が困難であることから難航している. これまでの研究において, 定性的ではあるものの, オスと比較するとメス胚由来始原生殖細胞は培養効率, 増殖速度が極めて低いことが明らかとなっている. そのため, 当初計画で予定されているfoxl3の機能解析を遂行するためには, 培養条件下における始原生殖細胞の性差を解明すること, ならびにメス胚由来始原生殖細胞の安定的な培養系の確立が求められる. 以上のことから,始原生殖細胞の性決定機構の解明に関しては期待以上の成果が得られているものの, 機能解析を行う上では課題が残されているため, おおむね順調に進展していると判断した.
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度では, 前年度から行なっている始原生殖細胞の性決定機構の解析を引き続き行う. 本解析では, 昨年度から実施しているqPCRを用いた発現解析を引き続き行う. 現状では5因子の発現解析を終えており, 今年度は合計10因子程度の遺伝子発現パターンの解明を目標とする. また, 昨年度行なっている細胞刺激試験においても, 同様に標的因子を増やし, 性決定機構を包括的に評価する. これらの研究によって得られた成果を研究論文にまとめ, 発表する.
一方で, 始原生殖細胞の培養条件下における性差の解明は, 本研究で当初予定していた機能解析への応用に加え, 性差の維持機構を明らかにするうえで学術的にも重要であると考える. そのため, 上述した発現解析に加えて, 培養始原生殖細胞の性差に着目した研究も並行して実行する. はじめに, 同一条件下のオス, メス由来始原生殖細胞の細胞増殖活性を定量的に解析する. 続いて, 未分化性の指標となるNanog等の遺伝子発現量の差異をqPCRにより明らかにする. さらに, RNA-seqにより, 培養下において, 性差の維持に機能しうる遺伝子群を同定する. 得られた成果を研究論文にまとめ, 発表するほか, メス胚由来PGCsの安定的な培養を目的とした, 新規培養手法の確立を考察する. 効果的な培養系を確立できた場合, 時間の許す限り, foxl3の機能解析を行う. foxl3の機能解析では, ゲノム編集技術を用いて, foxl3をノックアウトしたメス胚由来PGCsを初期胚に移植し, 生殖細胞の雌性分化に及ぼすfoxl3の機能を明らかにする. foxl3の発現時期は, メス胚に特徴的な卵原細胞の増殖期に相当することが明らかになっているため, 当該発生ステージの生殖腺を用いた組織学的解析, 並びにSTRA8等の性分化関連因子の発現解析を行う.
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