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2019 Fiscal Year Annual Research Report

新規ゲノム編集ツールの開発と機能未知遺伝子解析への応用

Research Project

Project/Area Number 19J22776
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

池田 有沙  東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(DC1)

Project Period (FY) 2019-04-25 – 2022-03-31
KeywordsCRISPR/Cas / HypaCas9
Outline of Annual Research Achievements

本研究では、CRISPR/Casシステムの新規ツールの開発および機能評価と、その技術を利用した遺伝子改変動物の作製による、機能未知遺伝子の逆遺伝学的な解析に取り組んでいる。
はじめに、遺伝子改変動物作製におけるモザイク変異回避技術の確立を目指し、Cas9-gRNAの薬剤誘導型オフスイッチERT2-AcrIIA4を開発した。本ツールは、哺乳類培養細胞で薬剤依存的にCas9を阻害できる一方で、マウス受精卵では薬剤添加区でもCas9を阻害することができなかったため、モザイク変異回避に利用することは困難であると結論づけた。
続いて、培養細胞でオフターゲット作用の低減が認められた改良型Cas9の一つであるHypaCas9について、マウス受精卵での利用可能性を検討した。その結果、標的座位に対する高いオンターゲット活性を保持しながら、オフターゲット活性が顕著に抑制されることが明らかとなった。さらに、この正確性を応用し、SNPの識別を介した高効率なアリル特異的変異導入が可能であることを明らかにした。この技術は、ホモ欠損では致死となってしまうような必須遺伝子を標的としたノックアウト動物の作製・系統化において特に有用となると期待され、実際に必須遺伝子Cdk1を標的としてアリル特異的に機能欠損変異を導入し、Cdk1ヘテロ欠損の生存産仔を高効率に作製することに成功した。
また、上記のツール開発・機能評価と並行して、マウス機能未知遺伝子Armh3の機能解析を進めてきた。Armh3タンパク質は、ゴルジ体の機能に関わる分子として近年注目されはじめたものの、その具体的な分子機能は未だ解明されていない。本研究では、あらゆる生物種に保存された機能未知ドメインDUF1741を欠失させたArmh3変異導入マウスを作製した。今後は作製したKOマウスを用いてArmh3のin vivoでの機能解析を進める予定である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初は、薬剤誘導型CRISPR阻害ツールを用いて、受精卵ゲノム編集のモザイクリスクを回避する技術の確立を計画していたが、本研究の結果から受精卵では十分なモザイクリスク回避には利用できないことが示唆された。そこで、Cas9変異体による精密な受精卵ゲノム編集ツールの開発に転換し、1塩基レベルの正確な識別が可能な標的ゲノム編集系の確立に至った。さらに、この系は系統間アレル特異的な編集にも応用できることを実証した。これにより、これまでは極めて困難であった、受精卵ゲノム編集による必須遺伝子を対象とした変異個体作製が可能となり、研究計画進展の加速化に寄与した。また、この新規ゲノム編集系を利用して、申請内容で挙げた機能未知遺伝子の変異マウス系統の作製を完了している。この機能未知遺伝子について、細胞内局在や相互作用因子を一部決定しており、ヘテロ変異個体同士の交配も開始していることから、2年目においても研究の順調な進展につながると期待される。

Strategy for Future Research Activity

これまでに、機能未知ドメインDUF1741を欠失させたArmh3変異導入マウスを作製した。今後はさらに、Armh3のORF全長を欠失させたArmh3 KOマウスを作製し、2系統のKOマウスを用いてArmh3のin vivoでの機能解析を進める。
Armh3は着床前胚やすべての臓器で発現が認められたことや、これまでの知見を統合すると、ユビキタスにゴルジ体の機能を介して必須遺伝子として重要な役割を果たしているという作業仮説が挙げられる。そこで、今後は初期胚発生におけるArmh3の重要性に着目し、作製したArmh3 KOマウス初期胚または発現抑制胚において、ゴルジ体の形態や機能の異常が認められるか検証を進める予定である。
また、これまでに野生型および変異導入マウス由来のArmh3配列や、Pi4kbなどの相互作用因子、ゴルジ体マーカーArf1などの配列をクローニングし、蛍光タグやFlagタグを付加した発現ベクターを作製し、既報と同様にArmh3がゴルジ体に局在することやPI4KBと相互作用することを確認した。これらのベクターを利用して、Armh3のゴルジ体因子との相互作用やPI4Pレベルに与える影響など、その分子機能についてin vitroでの生化学的な解析もin vivo解析と並行して行う予定である。

  • Research Products

    (3 results)

All 2019

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (1 results)

  • [Journal Article] Generation of genetically modified mice using SpCas9-NG engineered nuclease2019

    • Author(s)
      Fujii Wataru, Ito Haruka, Kanke Takuya, Ikeda Arisa, Sugiura Koji, Naito Kunihiko
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 9 Pages: -

    • DOI

      10.1038/s41598-019-49394-5

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] High-fidelity endonuclease variant HypaCas9 facilitates accurate allele-specific gene modification in mouse zygotes2019

    • Author(s)
      Ikeda Arisa, Fujii Wataru, Sugiura Koji, Naito Kunihiko
    • Journal Title

      Communications Biology

      Volume: 2 Pages: -

    • DOI

      10.1038/s42003-019-0627-8

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] マウス受精卵のゲノム編集におけるHypaCas9の利用可能性の検討2019

    • Author(s)
      池田有沙、藤井渉、杉浦幸二、内藤邦彦
    • Organizer
      第112回日本繁殖生物学会大会

URL: 

Published: 2021-01-27  

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