リンパ管新生に着目した犬の腸リンパ管拡張症の病態解析

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19J22813
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 永原 拓朗 東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2019-04-25 – 2022-03-31
• Keywords: 犬 / 腸リンパ管拡張症 / 胸管 / MRI / リンパ管内皮細胞 / 一酸化窒素

Outline of Annual Research Achievements

昨年度に確立したMRIによる胸腹部のリンパ管の描出方法を用いて、実際に動物病院に来院する症例での胸腹部のリンパ管サイズの評価を行った。一部の症例では小腸だけでなく胸部のリンパ管も拡張している可能性があることを見出した。
免疫組織化学により小腸組織におけるリンパ管の太さと数の評価およびLYVE-1とKi-67の二重染色によるリンパ管新生の評価を行った。犬の小腸組織におけるリンパ管の拡張は粘膜面だけでなく粘膜下織や筋層、さらには腸間膜でも認められることを明らかにした。一方でリンパ管の数には有意な差は認めず、二重染色の結果からもリンパ管新生の異常を示唆する知見は得られなかった。
リンパ管が拡張する原因として一酸化窒素の平滑筋を弛緩させる作用に着目した。Realtime PCRの結果から症例では一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現量が上昇しており、一酸化窒素の過剰産生が腸リンパ管拡張症の病態に関与している可能性が考えられる。免疫組織化学を用いてタンパク質レベルで発現量を評価し、本疾患と一酸化窒素の関連性をより詳細に解析する。
昨年度にラット胸管からのリンパ管内皮細胞の分離/培養方法を確立した。今年度はその技術を活かしてIn vitroの実験を行っている。本来は犬のリンパ管内皮細胞を用いた実験を行いたいが、今年度はサンプリングの機会に恵まれず細胞を手に入れることができなかった。ラット由来の細胞を用いて実験系を確立し、犬のリンパ管内皮細胞が入手できた際には速やかに本実験を開始できる見込みである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

犬の腸リンパ管拡張症では粘膜面だけでなく小腸の筋層や腸間膜のリンパ管も拡張しており、さらに一部の症例では胸管も拡張している可能性を見出した。研究計画の立案時にはリンパ管新生に着目していたが、ここまでの研究からリンパ管新生が犬の腸リンパ管拡張症の病態に関与していることを示す所見は得られなかった。
本疾患の病態に関する新たな仮説として、一酸化窒素に着目した。一酸化窒素は平滑筋を弛緩させる作用をもつ。過剰な一酸化窒素によりリンパ管の平滑筋が弛緩し、拡張を生じると仮説を立てた。Realtime PCRの結果から一酸化窒素の過剰産生を生じている可能性が示唆される。タンパクレベルの評価を行うとともに、昨年度に確立したリンパ管内皮細胞の初代培養を用いて分子生物学的な解析を行う。

Strategy for Future Research Activity

研究計画の立案時にはリンパ管新生に着目していたが、ここまでの研究からリンパ管新生が犬の腸リンパ管拡張症の病態に関与していることを示す所見は得られなかった。今後はリンパ管が拡張する原因として一酸化窒素の平滑筋を弛緩させる作用に着目して研究を行う予定である。Realtime PCRの結果から、症例では一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現量が上昇しており、一酸化窒素の過剰産生が腸リンパ管拡張症の病態に関与している可能性がある。今後は免疫組織化学を用いてタンパク質レベルで発現量を評価し、本疾患と一酸化窒素の関連性をより詳細に解析する。さらにリンパ管内皮細胞を用いて一酸化窒素の過剰産生を生じる分子生物学的な機序についても検討を行う。