2019 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
19J23441
|
|---|
| Research Institution | Kyoto University |
|---|
Principal Investigator |
中村 駿志 京都大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
|
| Keywords | 概日リズム / シロイヌナズナ / 単一細胞（シングルセル）レベル / プロトプラスト / 発光モニタリング / 細胞自律性 / 組織特異性 / 細胞時計 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では単離単一細胞の概日リズム解析を用いることで、①外部刺激による単一細胞時計の調節機構、②細胞間における時間情報伝達機構を明らかにする。上記二点を明らかにすることで、各細胞時計の時間情報を統合することによる、植物個体としての環境変動への適応機構を解明することを目指している。
概日時計は、大半の生物が有する日周や季節などの周期的な環境変化に適応する機構である。植物の概日時計は個々の細胞が自律的に機能すると考えられてきたため、多くの報告は植物体を研究単位としていた。近年、器官・組織レベルの解析によって、維管束から葉肉細胞、茎頂から根などの他の機関への時間情報の伝達が報告された。しかし、時間情報の伝達機構は不明な点が多いため、より詳細なレベルの解析が必要である。
パーティクルボンバードメント法を用いて概日発現発光レポーター遺伝子を植物体に一過的に導入することで、葉において原形質連絡を介した組織・細胞間の物質連絡により細胞時計が制御されている可能性が考えられた。細胞時計に対する細胞間相互作用の影響を正確に評価するために単離した単一細胞の概日リズム解析が求められている。
平成31年度は、①外部刺激による単一細胞時計の調節機構を明らかにするために、「光刺激による単離細胞時計の入力機構」を中心に研究し、その成果を学会等で発表した。LED光源による細胞への光照射によって、シロイヌナズナの葉から単離した細胞において概日リズムの位相のリセットが見られ、単一細胞レベルで外部刺激に対する細胞時計の細胞自律性が明らかになった。加えて、シロイヌナズナの根から単離した細胞においても同様に概日リズムの位相がリセットすることが分かった。このため細胞時計の時刻合わせにおいて、組織特異性は現れにくいことも明らかとなり、細胞時計の性質の一つを明確にすることができた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
平成31年度の研究計画では、①外部刺激による単一細胞時計の調節機構を明らかにするために、「光刺激による単離細胞時計の入力機構」を中心に研究を行う予定であった。光刺激による単離細胞時計の入力機構を調べるためにLED光源にて光を細胞に照射した。光の照射方法にも工夫し、1時間の一過的な光刺激や12時間おきの周期的な光刺激を施した。1時間の一過的な光刺激によって単離細胞時計の入力機構を葉と根から単離した細胞において示すことができた。加えて、12時間おきの周期的な光照射（明暗サイクル下）において、根から単離した細胞は葉から単離した細胞に比べて安定した光応答性（ピーク時刻）を示した。細胞密度の低い孤立した葉から単離した細胞では、発光概日リズムのピーク間隔はサイクルごとに変動し、不安定であったが、細胞密度を高くすると、安定化し、概日リズムの持続性も向上した。この結果は細胞周辺の細胞や物質を含めた環境が概日時計に影響を与えていることを示唆しており、次年度に実施する予定であった②細胞間における時間情報伝達機構の解明に繋がる成果も得られた。さらに、概日時計システムの入力系（外部刺激）の一つである温度においても細胞の安定性とリズムの関係の一部を示す結果を得ることができたため、本年度は当初の計画以上に進展していると思われる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度は、本研究での研究目的である単離単一細胞の概日リズム解析を用いた「①外部刺激による単一細胞時計の調節機構」と「②細胞間における時間情報伝達機構」の解明を繋ぐような成果を得ることを目的とする。
平成31年度の研究によって、単離細胞におけるリズム特性を明らかにすることができた。また、LED光源を用いた光刺激によって単離細胞の概日時計が調節されることを単一細胞レベルで明らかにすることができ、それらを学会発表等で報告した。加えて、シロイヌナズナの葉と根から単離した細胞は単離する前の器官の特徴を有しており、リズムの安定性や応答性に差が見られた。そのため、本年度はより詳細に単離細胞の器官特異性を調べるとともに、研究の目的の一つである「細胞時計に影響する時間情報伝達物質の探索」を重点的に実施する。
まず、細胞時計に影響する時間情報伝達物質を探索するために、単離単一細胞の生物発光測定条件を利用し、単離細胞に対して物質添加による一過的な処理と培地交換による周期的な処理を施す。パソコン制御による自動化が必要となるため、パソコン制御による物質添加・排除できる装置を任意サイクルタイマーと高性能チューブポンプと関連部品にて開発する。その際に各単離細胞の発光は画像として連続的に取得し膨大なデータ量を処理する必要があるため、パソコン関連部品を整備する。単離細胞の概日リズムを制御する時間情報伝達物質を探索することができれば、個体内で生じている現象の解明に大きく貢献できる。また、複数の代謝遺伝子などの発現を観測する発光レポーターをクローニングし、単離細胞に導入し、概日リズムとの関連性を調べる。発光レポーターを用いた概日リズムの発現解析と同様にRNAシーケンスを用いて発現変動を解析することで、時間情報を伝達する分子的な機構の解明に迫る。
|
