2019 Fiscal Year Annual Research Report
次世代ボルナウイルスベクターの開発と遺伝子治療への応用
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19J23468
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
神田 雄大 京都大学, 医学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | ボルナ病ウイルス / ウイルスベクター / 遺伝子治療 / リバースジェネティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ボルナウイルスベクター（REVec）の人工合成を効率化するため、リバースジェネティクス法を改良した。具体的には、（１）ボルナ病ウイルス（BoDV）のゲノム3'末端には、複製に伴い4塩基程度の多様性のある配列が付加され、この配列がBoDVのゲノム複製効率に影響していることを明らかにした。既報において、効率的なゲノム複製のためにはゲノム5'末端と3'末端が相補的な配列になり、panhandle構造を形成することが必要と考えられていたが、本研究では、panhandle構造ではなく、3'末端の配列がゲノム複製効率に影響することを明らかにした。そこで、REVec合成用のプラスミドにコードされるBoDVアンチゲノムの3'末端配列を効率的な合成を可能にする配列に変更した。（２）BoDVの転写複製に必須の補助遺伝子であるN遺伝子とP遺伝子を様々なウイルス株からクローニングし、効率的なREVecの合成を可能にするN遺伝子とP遺伝子を選抜した。また、これらの遺伝子を発現するプラスミドの導入量を最適化した。（３）BoDVの転写複製に必須ではないM遺伝子とG遺伝子を導入することで、REVecの合成が促進されることを明らかにした。また、これらの遺伝子を発現するプラスミドの導入量を最適化した。
これらの研究により、REVecの合成に要する期間を、従来の約2カ月から2週間に短縮した。また、改良法では実験開始から3日目には一定量のREVecを回収できるため、ベクターの性状や遺伝子発現を早期に解析することが可能になった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度までの研究により、REVecの効率的な合成系を確立し、臨床応用に向けた研究の基盤を強化することができた。また、（１）の研究から、BoDVが非常にユニークなゲノム複製を行っている可能性が考えられた。この分子学的基盤やウイルス学的な意義をより詳細に解明するため、米国の研究チームとの共同研究を開始した。一方、（２）の研究から、選抜したウイルス株が高い転写複製活性を有していることが明らかになった。近年、BoDVを原因とするヒトの致死性脳炎の症例が散発しており、本ウイルス株もヒトに高い病原性を示す可能性が考えられる。本ウイルス株を分離した研究チームと連携し、遺伝子解析、リバースジェネティクス系の確立、病原性の解明を行う準備をしている。
REVecの臨床応用に向けた開発を進める中で、新たなBoDVのウイルス学的な知見も明らかすることができており、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
感染性ウイルス粒子の形成に必要なM遺伝子とG遺伝子を欠損させた非伝播型ベクター（REVecΔMG）を用いて、神経細胞に起因する遺伝子疾患をターゲットにした遺伝子治療の開発に取り組む。
（１）BoDVは核内に持続感染するウイルスであるため、僅かなウイルス粒子しか形成しない。そのため、動物実験に必要となる高力価のREVecΔMGを調整するには、大容量の培養細胞が必要である。また、REVecΔMGは感染性ウイルス粒子を形成するために、M遺伝子とG遺伝子を人工的に補充しなければならない。そこで、BoDVに感受性を示す培養細胞の中から、高力価のウイルスを回収することができる細胞を選抜し、M遺伝子とG遺伝子を恒常発現させることでREVecΔMG産生細胞を樹立する。これまでの研究から、M遺伝子とG遺伝子の発現量がウイルス力価に影響することが明らかとなっているので、プロモーターの組み合わせ等を工夫し、遺伝子の発現量を最適化する。また、低コストでの細胞の大量培養を実現するため、ベクター産生細胞の浮遊培養化の可能性を検討する。
（２）神経細胞に起因する遺伝子疾患の中で、AAVベクターなどの既存のウイルスベクターでは治療が困難な遺伝子疾患をターゲットとし、REVecによる遺伝子導入が有効と考えられる疾患を決定する。また、疾患モデル動物の有無を調べ、動物実験の準備を進める。
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