2019 Fiscal Year Annual Research Report
基質模倣物による水酸化酵素の制御を利用した菌体内物質変換系の開発
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19J23669
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
唐澤 昌之 名古屋大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | バイオ触媒 / 菌体触媒 / シトクロムP450 / 大腸菌 / 酸化反応 / 擬似基質 / ポリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本申請課題は、不活性な炭化水素を水酸化し、より有用な化合物へと変換する菌体触媒の開発を目標とする。シトクロムP450BM3は長鎖脂肪酸を水酸化する酵素であるが、「擬似基質」と呼ばれる基質の模倣物を取り込ませることで、通常では水酸化できないベンゼンやプロパンといった非天然基質を水酸化可能となる。しかし、P450BM3は反応を行う際にエネルギーとして高価なNADPHを消費してしまい、このことが応用への障壁となってきた。そこで本研究では、P450BM3を発現させた大腸菌に擬似基質を取り込ませ、生体内のNADPH供給を利用して反応を行う、より実用的な菌体触媒の開発に取り組んでいる。当該年度では主に、「擬似基質の大腸菌への取り込み機構の解明」および「擬似基質の取り込みを促進するシステムの構築」に成功した。これまで、擬似基質がどのようにして大腸菌に取り込まれているか未解明であったが、膜タンパク質の一種であるポリンの遺伝子を欠損させた大腸菌を用いた実験から、擬似基質がポリンを通過していることが示唆された。さらに、ポリンの孔のサイズを広げた変異体を設計し、ポリン変異体とP450BM3を大腸菌に共発現させることで、ベンゼンの水酸化生成物量を最大で約20倍増加させることに成功した。当研究室が保有する擬似基質ライブラリーの中で、菌体反応に有効な化合物はわずかしかなかったが、ポリン変異体を発現させた大腸菌では、様々な擬似基質がベンゼンの水酸化を促進した。先行研究から擬似基質の構造を変えることで、水酸化の立体選択性を制御できることが明らかとなっているため、P450BM3とポリン変異体を共発現させた大腸菌によるインダンの水酸化を行うと、精製した酵素を用いた場合と同様の立体選択性で水酸化生成物が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
擬似基質の大腸菌への取り込みに関与するタンパク質を特定し、取り込みを促進する変異体を開発できたという点で、当申請課題は計画以上に進展していると言える。また、擬似基質の構造と菌体反応への有効性に関する情報も得られつつあり、菌体反応に優れた擬似基質の設計が可能になると考えている。さらに、ベンゼン以外の基質でも菌体反応で変換可能であることが明らかとなり、基質適用範囲のさらなる拡大が期待できる。現在、菌体が産出可能な化合物を擬似基質とする反応系の開発に着手し、菌体間コミュニケーション物質およびその代謝物とP450BM3との共結晶のX線構造解析に取り組んでいる。その内の一つであるアシルホモセリンと呼ばれる化合物と、P450BM3との共結晶について構造を解くことに成功しており、擬似基質としての応用可能性が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
当該年度で明らかとした取り込みの機構に基づいて、菌体反応に優れた擬似基質を開発する。また、設計した化合物の取り込みを促進するタンパク質を活用し、基質の適用範囲の拡大を目指す。菌体間コミュニケーション物質とその代謝物に関して、擬似基質としての活性を精製した酵素および菌体触媒を用いて評価する。
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