2019 Fiscal Year Annual Research Report

微生物の全ゲノム解析を実現する「DNA非切断型」Target-AID技術の拡張

Research Project

Project/Area Number	19J40073
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	坂野聡美大阪大学, 情報科学研究科, 特別研究員(RPD)
Project Period (FY)	2019-04-25 – 2022-03-31
Keywords	大腸菌 / 合成生物学 / ゲノム編集 / CRISPR / 遺伝子工学
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、DNA を切らずにゲノム編集を行うTarget-AID 技術を、次世代の合成生物学、遺伝子工学を飛躍的に発展させる基盤技術として確立することを目的とする。具体的には、塩基置換融合酵素dCas9-PmCDA1 と配列認識モジュールCRISPR-gRNA を原核生物に導入するだけで、複数の標的DNA の同時編集を簡便かつ高確率に行うよう、［基本技術の構築］［技術の拡張］を行い、［応用・実用化］に向けて研究を進める。現在は、大腸菌ゲノムの標的1遺伝子内に、ある程度効率よく変異を導入することが可能となっている。しかしながら、複数の標的DNA への同時塩基置換を、簡便化かつ高効率化することが課題である。そこで、本課題1年目では、［基本技術の構築］として、塩基置換を効率よく行うためのTarget-AID の改良を行った。まずは塩基置換酵素であるdCas9-PmCDA1をつなぐリンカーの長さを変化させたときの塩基置換効率を調べた。その結果、リンカー長を短くした場合には塩基置換効率が落ちることがわかり、効率の上昇するバリアントは同定できなかった。また、rifampicin耐性によるスクリーニング法以外の、新たな標的遺伝子の探索を行った。次に、［技術の拡張］に向けて、複数遺伝子の塩基置換を簡便に行うために、Combi-OGAB法を用いたCRISPR-gRNAプラスミド構築を試みた。その結果、大腸菌ゲノム上にある標的とした異種6遺伝子が同時に塩基置換されることを確認できた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ゲノム編集をより効率の良いものにするために、機能向上 Target-AID (Hyper Target-AID) の作製を試みた。塩基置換融合酵素であるdCas9-PmCDA1をつなぐリンカー長のを変化させたときの塩基置換効率を、rifampicin 耐性によるプレートスクリーニングを用いて調べたが、特に大きく効率が良くなるものは同定できなかった。次に、rifampicin耐性以外のスクリーニング法を確立するために、targetとしてpyrD, pyrE, pyrF (5-FOA耐性), thiA (trimethoprim 耐性) を選定し、塩基置換を行った。今後は、これらのプレートスクリーニング法を確立し、塩基置換効率をよりモニターできる系として利用できるようにしたい。また、致死遺伝子であるftsA, ftsZ, mreB, mreC, mreDなどの細胞の形態にかかわる遺伝子群に、終始コドンを導入するような塩基置換を確認した。この変異が入ることで、菌体が生存するためにおそらく別の部位に突然変異が起こっていると予想される。これらを全ゲノムシーケンスすることで、致死遺伝子の未知の遺伝子ネットワーク等の知見が得られるのではないかと期待される。そして、複数遺伝子の同時塩基置換をより効率よく行うという観点から、combi-OGAB法を用いて、代謝に関わる６遺伝子 (galk, xylB, manA, pta, adhE, tpiA) を一つのCRISPR-gRNAプラスミドに構築した。塩基置換アッセイの結果、6遺伝子の同時塩基置換を確認することができた。
Strategy for Future Research Activity	［技術の構築と拡張］combi-OGAB法によるプラスミド構築は、理論上10種類以上もの遺伝子を並べて一つのプラスミドに構築することが可能であるのだが、実際には、今回の6遺伝子でさえもsgRNAのリピート配列の影響などにより構築にたいへん時間がかかることが明らかとなった。今後は、CRISPR-gRNAの構築法を再検討するとともに、大腸菌にgRNAをエレクトロポレーション法などで直接挿入する方法を検討し、他の原核生物などにも適用可能な技術として拡張を試みる。 [応用・実用化] 本研究で構築したゲノム編集技術を実用化するために、有用物質生産株の作出を検討する。例えば、有用物質を効率よく生産する in silico予測に基づいた多重遺伝子破壊大腸菌株を作製し、その表現型を適宜、GC, HPLC 等を用いて検証したい。