2019 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the switching mechanism of chitin triggered immunity and AM symbiosis in rice
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19J40279
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| Research Institution | Meiji University |
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Principal Investigator |
宮田 佳奈 明治大学, 明治大学 農学部, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2020-01-06 – 2023-03-31
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| Keywords | OsCERK1 / イネ / 菌根菌共生 / LysM型受容体キナーゼ / OsSYMRK |
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| Outline of Annual Research Achievements |
イネのLysM型受容体キナーゼOsCERK1は、共生応答と防御応答という対照的な２つの応答の起動に関わる。しかし、同一の受容体がどのようなメカニズムで、適した応答を起動するのかについては未だ詳細が明らかになっていない。一方でOsCERK1はGPIアンカー型受容体CEBiPと複合体を形成し、8量体キチンを認識することで防御応答を起動することが分かっており、申請者はこの知見から、OsCERK1が複合体を形成するパートナー受容体を変えることにより、異なる応答を選択的に起動するのではないかと考えた。しかし、菌根菌共生の誘導に関わるパートナー受容体の実体は不明である。そこで本研究では、イネにおいてOsCERK1と共に菌根菌共生の誘導に関わる受容体の探索を目的とした。
イネの菌根菌共生においては、キチン4量体がシグナル分子であると考えられている。本年度は、キチン4量体と受容体タンパク質間の結合実験のセットアップを行い、同時にOsCERK1とキチン4量体との結合能を解析した。実験の結果、キチン4量体とOsCERK1の間に結合は見られなかったことから、キチン4量体に対する応答を誘導するには、OsCERK1の他に何らかの別の受容体が必要である可能性が示唆された。
また、OsCERK1と相互作用する可能性のあるOsSYMRK受容体に関しても機能解析を予定しており、本年度は解析に必要なベクター作成を完了した。来年度以降、これを用いて形質転換体の作成を行う予定である。
今後菌根菌共生への関与の指標の一つとして、Ca2+の濃度振動（Ca2+スパイキング）の解析を予定しているが、イネにおけるCa2+スパイキングは明瞭な検出が困難であることが指摘されていた。そこで、オランダのワーゲニンゲン大学に滞在して、近年の知見や情報を収集し、Ca2+スパイキングを明瞭に検出できる実験条件を探索した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は研究をスタートした2020年1月から3月までの3か月間という短い期間であり、本課題に関わる結果が本格的に出始める前の時点に相当する。しかし、その短期間の中でもベクターの作成などの作業を着実に進めることが出来、またビオチン化キチンを用いた、受容体とキチン4量体の結合実験のセットアップも完了した。本解析の結果では、OsCERK1とキチン4量体との結合は見られなかった。これまで、OsCERK1とキチンの8量体が結合しないという結果は議論されてきたが、キチン4量体に対する結合実験の結果は新規に得られたものである。この結果から、OsCERK1がキチン4量体に対して応答するためには、キチン4量体を認識できるOsCERK1以外の何らかの受容体が必要となる可能性が示唆された。次年度以降も引き続いて、イネに存在するLysMモチーフを持つタンパク質に対して、キチン4量体との結合実験を行う予定であり、その準備も計画通り進めることができている。
これらの実験に加え、オランダのワーゲニンゲン大学の滞在で、イネのCa2+スパイキング解析における実験条件の最適化を目指した実験を行った。しかし、オランダ国内のCOVID-19の感染拡大に伴い、滞在期間を大幅に短縮して帰国しなければならず、十分な結果を得るには至らなかった。しかし、本滞在期間中に、ヨーロッパ圏の共生分野における研究のグループから、イネのCa2+スパイキングの技術に関する情報収集を広く行うことができた。また、ワーゲニンゲン大のRene Geurtsらのグループと今後の研究についても議論を重ね、共同研究の為のMTAを交わすことができた点も、大きな成果として挙げられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、本年度作成したベクターを用いて、ossymrk変異体などの形質転換体の作出を行う予定である。また、引き続きLysMモチーフを持つ候補タンパク質に対して、ビオチン化キチン4量体を用いた結合実験を予定しており、本研究の目的であるOsCERK1と複合体を形成し、菌根菌共生において機能する受容体の同定を目指す。イネのCa2+スパイキングの解析における条件検討に関しては、本年度では終了しなかったが、オランダでの情報収集は完了しており、受け入れ研究機関においてさらなる検討を続ける。
問題点としては、当初の研究計画で行う予定であった、イネにおけるキチン4量体とキチン8量体に対する網羅的発現解析について、イギリスのグループが既に同様の実験を開始しているという情報を得た。その為当実験は行わず、菌根菌共生に関わる受容体が同定された後、その因子の変異体を用いてキチン4量体に対する網羅的発現解析を行う計画に変更することとした。
また、受け入れ研究機関において、COVID-19の感染拡大防止の為、研究室が閉鎖されたため、帰国後以降の実験作業等の研究を一時的に停止せざるおえなくなり、形質転換体の作成とその評価などに関して、次年度の研究の遅延が予想される。在宅勤務期間中は論文執筆に加え、イネに存在するLysMモチーフを持つタンパク質それぞれに関して系統樹解析を行うなど、自宅で出来る範囲の仕事を継続して行っている。実験作業が遅れる一方で、在宅勤務中に成果も挙がっており、これまで1つしかないと考えられていたイネのLjNFR5/MtNFPホモログタンパク質であるが、O. sativa subsp. Indicaのデータベースに、類似したタンパク質がもう一つ存在することが明らかになった。今後、実験に用いている日本晴（BL2）においてこの遺伝子の有無を確認し、候補遺伝子として新たに解析を進める予定である。
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