小胞体ーゴルジ体を経由しないガレクチン新規分泌経路の解明

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19J40312
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 山口 亜利沙 高知大学, 教育研究部医療学系, 特別研究員(RPD)
• Project Period (FY): 2019-10-01 – 2023-03-31
• Keywords: ガレクチン / 非古典的分泌経路

Outline of Annual Research Achievements

これまでに、赤色蛍光タンパク質であるmCherryに、EMARS反応触媒酵素であるAPEX（アスコルビン酸ペルオキシダーゼ）とガレクチン３を連結させ、さらに、HiBiT Tagを付加した”mCherry-APEX-ガレクチン３-HiBiT発現ベクター”を作製している。本ベクターをHeLa細胞に導入し、安定発現株を作製した（HeLa WT）。また、ガレクチン３の糖鎖認識部位に変異（R186S）を導入したガレクチン３糖鎖認識変異株も同時に作製した(HeLa R186S)。作製した細胞株において、ガレクチン３の分泌量を培養液中のHiBiTとその基質による発光にて測定したところ、HeLa R186S株の分泌量はHeLa WTに比べておよそ1/10の分泌量であった。また、コレステロール合成・輸送阻害剤であるU18666Aを添加すると、ガレクチン３の分泌量が、およそ２倍増加することが明らかとなった。

続いて、上記の細胞株および分泌条件を用いてEMARS反応を行い、SILAC法にて質量分析を行った。まず、細胞をLight(EMARSなし), Heavy(EMARSあり)の条件にて標識し、10日間培養した。標識した細胞にEMARS反応を行い、タンパク質量が1:1になるように混合し、LC－MS/MS質量分析を用いて解析した。その結果、Light<Heavyとなるタンパク質が204個同定された。この中には、Galectin 3およびmCherry-APEX-ガレクチン３も同定されていた。また、Log2 (ratio L/H)<-1のタンパク質として60S ribosomal protein, Heat shock protein HSP 90など13個が同定され、これらはガレクチン３分泌に関わる候補分子と考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

SILACによる質量分析を行ったため、非特異的なタンパク質の排除が可能となり、ガレクチン3の分泌に関わるタンパク質の同定の精度が上昇した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、同様のSILAC法による質量分析を数回行い、同定された候補分子について、CRISPR/Casテクノロジーを用いてノックアウトし、ガレクチン３の分泌が阻害あるいは抑制されるか否かを解析することで、がレクチン３の分泌に関わる分子を明らかにする予定である。