2019 Fiscal Year Research-status Report
Identification of the effective microorganism groups from sake lees by using the antigen presentation ability of dendritic cells
| Project/Area Number |
19K02336
|
|---|
| Research Institution | Takasaki University of Health and Welfare |
|---|
Principal Investigator |
今井 純 高崎健康福祉大学, 薬学部, 准教授 (30342918)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坂井 隆浩 高崎健康福祉大学, 薬学部, 助教 (10418618)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 樹状細胞 / 腸内細菌叢 / Th状態 / 抗アレルギー効果 / 有用菌 / ユビキチン / 自然免疫 / スクリーニング |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
発酵食品には抗炎症効果を示すものがあることが知られている。なかでも乳酸菌は免疫の司令塔である樹状細胞に働きかけThバランスを回復することで抗炎症効果を発揮することが証明されている。しかし、発酵食品に含まれる菌のThバランスに及ぼす影響を検証する場合、現在の手法では、菌を単離、純粋培養し株化、菌体や培養液を樹状細胞に添加したのちに、特定のサイトカインに対する抗体を使用したELISA法、サイトカインの転写を確認するRT-PCR法などによって、Th状態への影響を確認している。この方法では、多種類の菌を純粋培養する必要があるが、菌によって培養条件が異なることに加えて、培養によって代謝産物が変化するなど、直接的、網羅的な解析は不可能である。本研究の目的は酒粕などの各種食発酵食品から、樹状細胞（DC：dendritic cell）の抗原識別能力を利用し、Thバランスに影響を与えることで抗アレルギー効果を発揮する有用菌種を同定することである。令和1年は、単球由来のDCの培養細胞DC2.4に熱処理した酒粕を取り込ませ、Th1に分化したDCを2種類の蛍光タンパク質（Azg；Azami greenとKuo；Kusabira orange）を融合させたユビキチン（Azg-UbとKuo-Ub）の間の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET；Fluorescence Resonance Energy Transfer）によって、光学的に分離する。分離したDCの中から、PCRにより細菌ゲノムを特異的に増幅し、塩基配列を決定することで、乳酸菌のゲノムに由来するDNAを同定することに成功した。この乳酸菌のDCに対するTh1誘導効果を、IL-12に対する抗体を使用したELISA、サイトカインの転写を確認するRT-PCR、DCの交差抗原提示効率の定量などによって確認し、我々のスクリーニング法によって分離した細菌のDCに対する免疫誘導効果を検証している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1、現在のスクリーニング法は一過性遺伝子導入細胞を利用した実験系であり、スクリーニング効率はDC2.4に対する遺伝子導入効率に大きく依存し、実験間の差異が大きい。また、発酵食品（酒粕）状態の熱処理の時間などに由来すると考えられる材料由来の誤差が大きいこと、などの理由によって実験間で無視できない差異が生じている。これに対する対策は今後の推進方策（3、5）に示す。
2、DC2.4のTh1への分化効率を、IL-12に対する抗体を使用したELISA法、サイトカインの転写を確認するRT-PCR法などによって評価する実験系は安定した結果が得られていない。これに対する対策は今後の推進方策（2、4）に示す。
3、スクリーニング系の効率の向上改善を試みる。これに対する対策は今後の推進方策（3、4）に示す。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1、現在のスクリーニング系を用いての、スクリーニングを継続する。
2、DC2.4のTh1への分化効率を、樹状細胞の交差抗原提示効率の測定に基づいて定量化する実験系を構築している。
3、現在のスクリーニング系は2種類の蛍光ユビキチンの一過性遺伝子導入細胞を利用した実験系であり、スクリーニング効率はDC2.4に対する遺伝子導入効率に大きく依存し、実験間の差異が大きい。そこでより本実験系をより安定したスクリーニング系として確立することを目標として、安定遺伝子導入細胞の確立を目指した実験を行っている。
4、大腸のリンパ節において腸内共生細菌を検出し、Th1状態を誘導する作用の最も強いDCはcDC1であるが、現在のスクリーニング系はmo-DC由来の培養細胞であるDC2.4を使用している。moDCはcDC1と類似した病原体関連分子を検出するセンサー分子群を発現し、抗原刺激依存的な強いTh1誘導能力を持つが、より自然状態に近い抗原刺激に対する選択性を有するcDC由来の培養細胞であるmutuDCを使用した実験系を並行して開発し、現在のスクリーニングの結果を検証するとともに、さらに効率的なスクリーニング系を開発を目指している。
5、スクリーニングで得られた細菌を分離後、純粋培養を行い株化、その菌体、培養液などを樹状細胞由来の培養細胞、マウスの骨髄由来の樹状細胞に投与、
同定した菌がThバランスに与える影響を細胞レベルで確認する。
|
| Causes of Carryover |
該当年度には、論文3報を執筆発表したため、研究に充当すべき時間が少なかったため、消耗品の購入額が低く抑制され物品費が予想よりも少額であった。本年度はスクリーニングの件数を増やすので、翌年度分として請求したい。
|
