2022 Fiscal Year Research-status Report

Functional characterization of novel carotenoids-protein complex with aqueous properties found in vegetables and fruits

Research Project

Project/Area Number	19K02383
Research Institution	Kobe Women's University
Principal Investigator	安藤清一神戸女子大学, 家政学部, 教授 (80131986)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2024-03-31
Keywords	カロテノイド / 特異的タンパク質 / 水溶性 / 果実類 / 野菜類 / 電気泳動
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、野菜や果実類に存在するカロテノイドが水溶性に可溶化されることを見いだし、脂溶性カロテノイドの水溶性化に関わる特異的タンパク質の単離と構造上の特徴を明らかにすることを目的とする。これまで、β-カロテンを多く含有するニンジンやマスクメロン（赤肉）の果肉、β-クリプトキサンチンを多く含有するウンシュウミカンやビワの果肉をショ糖溶液や生理的食塩水などの水溶性溶媒でホモジナイズし、遠心分離することにより、上清画分にカロテノイドが存在すること、またゲル濾過カラムに対する挙動から上清画分中のカロテノイドはタンパク質と同一の溶出位置に存在すること、さらに上清画分は飽和度90%の硫酸アンモニウムによって塩析、濃縮されることを明らかにした。他方、果実類は酵素的褐変反応の進行が速く、上清画分に混入する黄褐色の褐変色素を除去することが困難であり、カロテノイドを水溶性に可溶化する特異的タンパク質の特定には、野菜類を実験材料に用いる必要があった。本年度、β-カロテンを多く含有するパプリカ（黄色）果肉を、4倍量の0.137M NaCl含有リン酸緩衝液(pH7.4)中でホモジナイズし、遠心分離(20,000 xg、30分、5℃)によって黄色の上清画分を得た。この上清画分を飽和度90%の硫酸アンモニウムで塩析、濃縮後、0.137M NaCl含有リン酸緩衝液に対して透析し、ゲル濾過カラムに供した。透析した上清画分に含まれるタンパク質の82.1%がゲル濾過カラムによって溶出され、447nmと432nmに極大吸収を示した。さらに、限外濾過膜（分画分子量30,000ダルトン）を使用した遠心濃縮(4,000 xg、60分、5℃)によって、ゲル濾過カラムの溶出画分は5.3倍に濃縮され、タンパク質の回収率は75.2%であった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本年度、β-カロテンを多く含有するパプリカ（黄色）果肉を対象として、脂溶性カロテノイドが水溶性化していること、その水溶性化に特異的タンパク質が関与していることを明らかにした。飽和度90%の硫酸アンモニウムによる塩析と濃縮、ゲル濾過カラムによる溶出、さらに限外濾過膜（分画分子量30,000ダルトン）を使用した遠心濃縮によって調製した画分を未変性条件下での電気泳動（ゲル濃度4-15%）に供した結果、黄色に着色した画分は濃縮ゲル上に留まり、泳動されないことが判明した。未変性条件下での電気泳動では、特異的タンパク質を単離することは難しく、この問題を解決するために、変性条件下での電気泳動を検討する必要が生じ、進捗状況がやや遅れている。脂溶性カロテノイドの水溶性化に関わる特異的タンパク質を単離するためには、変性条件下での電気泳動が有効であると考える。
Strategy for Future Research Activity	β-カロテンを多く含有するパプリカ（黄色）果肉を対象として、ドデシル硫酸ナトリウムを変性剤とする電気泳動によって、脂溶性カロテノイドの水溶性化に関わる特異的タンパク質を単離する。単離した特異的タンパク質のN末端および内部アミノ酸配列に基づき、タンパク質データベースを検索して、特異的タンパク質と相同性のあるタンパク質を特定する。また、脂溶性カロテノイドの結合に関わる特異的タンパク質の機能モチーフの特徴を明らかにする。
Causes of Carryover	3年余り、新型コロナウイルス感染予防の中で、研究活動のための時間を確保することが難しく、英文校閲や論文別刷等の経費が未執行となった。未執行の使用額を期間延長した最終年度に繰り越し、カロテノイドを可溶化する特異的タンパク質の単離に必要な消耗品費等に使用する予定である。