2020 Fiscal Year Research-status Report

回転分子モーター蛋白質の駆動力伝達部位の弾性が回転速度・トルクに与える影響

Research Project

Project/Area Number	19K03776
Research Institution	Osaka Medical College
Principal Investigator	古池晶大阪医科大学, 医学部, 准教授 (60392875)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ATP合成酵素 / 分子機械 / 分子モーター / 1分子観察 / 1分子生理学 / タンパク質の弾性
Outline of Annual Research Achievements	生命活動に不可欠なATP合成酵素（FoF1）は，2つの回転分子モーターFoとF1が共通の回転軸で連結されたユニークな構造を持ち，ナノスケールで働く「分子機械」のモデルとして広く知られている。慣性や重力を利用できないナノスケールで，熱運動に抗いながら1方向性の滑らかな運動を可能にする「分子機械の動作原理」は，マクロな機械のものとは全く異なるはずである。本研究では，駆動力伝達部位の弾性という物理的性質に着目した。FoF1の場合，回転軸の弾性が，回転運動の質と量にどのように寄与するのだろうか。 F1は，ATP駆動の回転分子モーターである。3個ずつのα，βサブユニットが円筒 (α3β3リング)を形成し，その中心にマッチ棒に似たγサブユニットが突き刺さっている。円筒内部に入り込んだマッチ棒の「棒」部は，反平行αヘリカルヘリックス構造である。マッチ棒の「頭」部を上方向とすると，γの「棒」部の上部領域，下部領域でα3β3リングと接触している。中間領域はα3β3リングと接触せず，直接相互作用することはない（シャフト部位）。シャフト部位の2本のαヘリックスのうちC末側の1本に自由回転部位を挿入した「回転軸の弾性を弱めた変異体A」と，2本ともに自由回転部位を挿入した「回転軸の弾性をゼロにした変異体N」を作製し，それらの回転運動を調べた。本年度は，この測定・解析を進め，ほぼ無負荷での回転速度は，野生型では～180回転/秒，変異体Aではほとんど同程度，変異体Nでは，～45回転/秒であった。また，変異体Aと野生型Foの複合体をリポソーム（人工脂質膜）内で再構成し，そのATP合成活性を測定したところ，野生型FoF1に匹敵する活性を持つことを確認した。これらの結果は，シャフト部位の弾性を弱めてもATP加水分解・合成速度にほとんど影響がないこと，あるいはシャフト部位の弾性が変化していないことを示唆する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 新型コロナウィルス（COVID-19）の感染拡大によって，2020年度当初から，大学への立ち入り禁止や遠隔授業の準備・開始など，大学業務の抜本的な変更を余儀なくされた。それに伴い，まとまった研究時間の確保が困難になった。特に，変異体作製・精製やATP分解/合成速度の測定など，生化学実験では，サンプルや測定試薬をまとめて使用する必要がある（フレッシュなものが必要であることと，再現を得るためがその理由である）。そのため，それらの実験を行うことが困難になり，本研究課題の遂行状況は遅れている。まとまった時間は取れなかったが，変異体の設計や回転運動の詳細な解析を行った。それに加え，光学系のリファインや金粒子の修飾方法改善など，実験再開後スムーズに実験を行うために必要な準備を整えた。当初の予定から遅れているとはいえ，時間的な制限が原因であり，計画の骨格自体に変更を迫られるような状況ではない。
Strategy for Future Research Activity	いまだ新型コロナウィルス（COVID-19）の影響は続いており，学内への立ち入り規制や，遠隔授業など研究以外の業務の増加によって，研究時間の確保が難しい状況が続くと予想される。状況が好転し次第，変異体作製・精製やATP分解/合成速度の測定などの生化学実験を再開する。特に，回転軸の弾性を弱めた変異体の種類を増やすことと，それらの変異体の回転運動の測定・解析に重点を置く。また，F1変異体Nと野生型Foの複合体がわずかでもATP合成活性を持つのかも，はっきりさせておきたい。それらの結果から，ATP合成酵素におけるトルク変換や速度制御に，回転軸の弾性がどのように寄与しているのか見積もる。
Causes of Carryover	新型コロナウィルス（COVID-19）の感染拡大によって，2020年度当初から，大学への立ち入り禁止や遠隔授業の準備・開始など，大学業務の抜本的な変更を余儀なくされた。それに伴い，まとまった研究時間の確保が困難になった。特に，生化学実験では，測定が予定通り行えず，測定試薬やサンプル調整のための消耗品の購入が滞った。次年度，生化学的実験が行えるような状況になり次第，必要な消耗品を購入し，次年度繰越額分は使い切る予定である。本年度分の助成金は，当初の計画通り使用する。