2020 Fiscal Year Research-status Report
Extracellular production of scFv using recombinant E. coli based on DO-stat fed-batch culture
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19K05162
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| Research Institution | Kyoto Institute of Technology |
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Principal Investigator |
堀内 淳一 京都工芸繊維大学, 分子化学系, 教授 (30301980)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ｓｃFv / fed-batch culture / DO-stat / E. coli |
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| Outline of Annual Research Achievements |
組換え大腸菌によるタンパク質発現系は遺伝子工学分野で広く用いられており、各種の異種タンパク生産において第1選択肢とされる基盤技術の一つである。このタンパク質発現系は、遺伝子組換え手法が確立されていることに加え、大腸菌の培養が容易で発現レベルも高く、安価な培地で大量生産が可能な利点がある。このため組換え大腸菌を用いたタンパク質発現系は抗体フラグメントや機能性ペプチド、各種酵素のような比較的低分子量で、糖鎖修飾が不要なタンパク生産に幅広く用いられている。
一方で組換え大腸菌によるタンパク質発現系はタンパク質が細胞質内に局在し、不溶化して多くが封入体（inclusion body）を形成する欠点を有する。目的タンパク質が封入体を形成した場合、下図に示す多段階の複雑な精製操作が必要で、精製コストが大幅に増加する。この分離精製コストは組換えタンパク生産における総コストの60-70％を占め、経済性を大きく左右する要因となっており、この点を改善する新規技術の開発が長年の課題であった。
申請者らは最近、ペリプラズム分泌シグナルを導入した組換え大腸菌を用い、溶存酸素濃度を精密に制御した長時間のDO-stat流加培養を行うことにより、医療診断に用いる単鎖抗体（scFv）を活性型のまま数g/Lのオーダーで菌体外に分泌生産できることを報告した。この手法が確立できれば遠心分離した培養液から直接タンパク質を精製することが可能となり、高コストな分離・精製プロセスを大幅に簡素化できる。このような背景の下、本申請では組換え大腸菌における単鎖抗体等の菌体外分泌メカニズムを明らかにし、その知見に基づいて組換え大腸菌により単鎖抗体等を活性型のまま菌体外に効率的に生産する培養手法を確立することを目的とする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
ｓｃＦｖ遺伝子としてanti-human IgG、anti-CRP、anti-CD9を用い、これらのscFv遺伝子のN末端側にペリプラズム分泌シグナル（pelB leader）、C末端側に精製用のHisタグを導入したpET-22発現ベクターを用いて、大腸菌Rosseta2(DE3)株を形質転換した。更に、scFvの高密度配向固定化を可能とする材料親和性ペプチドタグを導入した株も構築した。流加培養は、2Lジャーファーメンターを用い、PID制御に基づく精度の高いDO statによりグルコースを流加し、約100時間流加培養を継続した。
Anti-CRP scFv生産株を用いて培養を行った結果、IPTG添加後まずscFvが封入体として蓄積し、その後菌体外にscFvが蓄積され始め、最大約4.8g/LのscFvが上清中に生産された。次にAnti-human IgG scFv生産株、及びAnti-CD９ scFv生産株を用いて培養を行った結果、それぞれ最終的に4.4g/L、2.1g/LのｓｃＦｖが菌体外にリフォールディング不要な活性型として生産された。培養上清中にはscFv以外の細胞内タンパク質も溶出したことから、pelB leaderの導入により細胞膜の透過性が高まり長時間流加培養を継続することで大量のscFvが菌体外に溶出したと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本手法の適用拡大を進めるため、イムノアッセイ用単鎖抗体の種類や性質により菌体外生産特性がどのように変わるかを幅広く検討する。発現系はこれまでと同様とし、N末端側にペリプラズム分泌シグナル（pelB leader）、C末端側に精製用Hisタグを導入したAnti-CRP scFv、Anti-human IgG scFv、抗インフルエンザA型およびB型scFvなど分子量・等電点の異なる5種のタンパクをモデルタンパクとし、pET-22発現ベクターを用いてRosseta2(DE3)を形質転換し検討を行う。更に、当研究室で研究を進めているscFvの固定化担体への高密度配向固定化を可能とする材料親和性ペプチドタグを導入したscFv生産株も構築しその生産特性を検討する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナ感染拡大により昨年3月末～6月末まで研究室が閉鎖されたため実験を行うことができなかった。また7月以降に実験を再開したが、感染拡大防止のため研究室活動における人数制限が実施されたため進捗に遅れが生じた。現在は昨年9月より大学による研究室人数制限が解除されたので、感染拡大に配慮しながら実験を実施している。
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