2020 Fiscal Year Research-status Report
進化分子工学の可能性を無限大にするコドンのランダム置換・InDel法の開発
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19K05163
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡野 憲司 大阪大学, 生物工学国際交流センター, 助教 (40623335)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 進化分子工学 / コドン / 塩基置換 / InDel |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAに突然変異を誘発し、高機能変異体を選抜する「進化分子工学」は、タンパク質の高機能化のための強力な手法である。変異と選択というダーウィン進化を模倣・加速する本手法は、産業酵素の創出の常套手段の一つとなっている。進化分子工学的手法によって高機能な変異体を効率的に取得するためには、「変異体のバラエティ」と「発生頻度の均一性」が重要となる。つまり、1つのアミノ酸を19種のアミノ酸に等確率で変化させる技術の開発が重要である。また、近年ではアミノ酸の挿入・欠失（InDel）により、反応特異性の劇的な変化が見られたという報告もあり、InDel変異技術への需要も高い。そこで本研究課題では、標的DNAに対してアミノ酸を規定する「コドン単位」で「置換・InDel変異」を導入する技術の開発を行った。
本研究ではコドン単位の変異の導入にあたり、環状化したDNAをランダムな位置で開環し、開環部位にDNA加工を施すというアイデアを採用した。DNA加工の手法として、配列内部に相補配列を有する一本鎖DNAプライマーをデザインし、ステム&ループ構造と一塩基突出を形成させる手法を考案した。本DNAアダプターを、モデル遺伝子であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（cat）を含むプラスミドpMIN-catを特定箇所で切断した線状断片に付加した。その後、アダプターの不要配列の除去・自己環状化を行った結果、コドンの置換が可能であることを確認した。開発した方法をpMIN-catをDNA断片化酵素であるdsDNAフラグメンターゼで穏やかに処理しランダム開環した線状化DNAに適用したところ、いずれのプラスミドにおいても目的のコドン置換は確認されず、数十bp程度の欠失が生じていた。従って、本手法ではpMIN-catが少なくとも2か所以上で切断されていることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度一塩基突出を有する標的遺伝子へのアダプター付加方法として、配列の内部に一塩基突出を作成するためのBciVI制限酵素サイトを有するDNA断片をPCR増幅し、BciVI処理をすることでアダプターを得るという方法を開発した。2020年度はより簡便な方法として、配列内部に相補配列を有する一本鎖DNAプライマーをデザインし、ステム&ループ構造と一塩基突出を形成させる手法を考案した。デザインした一本鎖DNAアダプターを、モデル遺伝子であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（cat）を含むプラスミドpMIN-catを特定箇所で切断した線状断片に付加した。その後、アダプターの不要配列の除去・自己環状化を行った結果、コドンの置換が可能であることを確認した。
続いて、本手法をランダム開環したpMIN-catに適用し、ランダムな位置にコドン置換を導入できるかの確認を行った。ランダム開環は昨年度開発した環状化DNAにDNA断片化酵素であるdsDNAフラグメンターゼを低濃度で作用させ、一箇所だけで切断が生じランダム位置で開環されたDNA断片を得るという方法を採用した。dsDNAフラグメンターゼによってランダム開環したDNAは20%程度の一本鎖突出を有するため、これらの断片に一本鎖DNAアダプターの付加を行い、不要配列の除去と自己環状化を行った。得られたプラスミドDNAの配列を確認したところ、いずれのプラスミドにおいても目的のコドン置換は確認されず、数十bp程度の欠失が生じていた。本手法ではプラスミドをdsDNAフラグメンターゼで処理した後、電気泳動によりスーパーコイルDNAに相当するバンドが、直鎖DNAに相当するバンドへとシフトすることで、DNAがランダム開環していることを確認していた。しかしながら、本結果より、DNAは少なくとも2か所以上で切断されていることがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究成果により、標的DNA断片に対してアダプターを付加した後、アダプターに含まれるTypeIIS制限酵素（認識配列の外側で切断する酵素）で処理することにより、不要な配列を除去し、目的の塩基加工ができるということが分かった。一方で、ランダムな位置に塩基加工を施す方法として、DNA断片化酵素を低濃度で作用させることで環状DNAを一箇所のみで切断するという方法は不適であるということがわかった。これは、酵素反応の条件を穏やかにしすぎるとランダム開環されたDNAがほとんど得られず、条件を激しくすると2か所以上での切断が起こるためである。
従って、次年度はプラスミドのランダム開環を行うための方法として、dsDNAフラグメンターゼに変わる新たな酵素（または酵素の組み合わせ）を探索する。環状DNAに対しては作用するが線状DNAには作用しないような酵素（または酵素の組み合わせ）を探索できれば、今回発生したような長い欠失が発生するといった問題は解決できると考えらえる。このような手法を用いてランダム開環したDNAに対してアダプター付加を行い、不要配列の除去・自己環状化を行うことで、ランダムな位置にランダムな加工を施したDNAを取得し、大腸菌に導入する。その後、得られたコロニーよりプラスミドを抽出し、シーケンス解析を行うことで、コドンの挿入・欠失・置換など目的の変異が導入されていることを確認する。さらに変異導入の位置や種類などのランダム性についても評価を行う。
また得られた変異酵素の活性評価も実施する。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼは抗生物質耐性に関与する酵素であるため、得られた大腸菌群の抗生物質の強弱で簡易なスクリーニングが可能である。抗生物質耐性が高かったコロニーについては、実際に酵素活性の測定を行い、本手法によって高機能な変異体が得られるかどうかを評価する。
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| Causes of Carryover |
当初2020年度までに完成予定だったランダムコドンの導入方法に遅れがでたため、変異体の評価に使用予定だった費用が未使用となった。次年度はランダムコドンの導入方法と変異体の評価の両方を実施するために、研究を加速し、2020年度に未使用となった額とあわせて使用する。
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