Establishment of technology to dramatically increase the expression of foreign genes introduced by viral vector

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05165
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 荒尾 雄二郎 岡山大学, 保健学研究科, 教授 (40151146)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 外来遺伝子 / 遺伝子発現増大 / 哺乳動物細胞 / ウイルスベクター / 糖 / 強化型緑色蛍光蛋白質 / ポリカチオン / 高浸透圧

Outline of Annual Research Achievements

哺乳動物細胞での外来遺伝子発現は必要不可欠な基盤的科学技術である。本研究では、極めて高いとされるウイルスベクターによる外来遺伝子発現を、糖による細胞状態の適正化作用を利用して，さらに高くする技術を開発する。併せて、その糖の外来遺伝子発現増大効果を大多数の哺乳動物細胞で有効活用するための技術を確立する。
哺乳動物細胞におけるアデノウイルス（ADV）ベクターによる強化型緑色蛍光蛋白質（EGFP）発現を、糖が増大させ得るか否かを調査した。CV-1細胞ではADVベクターは非ウイルスベクターと比べて13.5倍の蛍光強度を実現したが、糖の細胞状態適正化は蛍光強度をさらに約12倍に増大させた。HepG2など他の細胞でも糖添加は蛍光強度を同様に増大させた。最大効果を実現する糖の種類と濃度は細胞により異なった。
ポリカチオンでTHP-1細胞やADV表面の負荷電を中和して、ADVベクターによるEGFP遺伝子導入の効率化を試みた。ADVベクターを0.750 mg/mL DEAEデキストラン塩化水素で前処理することで6.4倍もの高い蛍光強度が得られた。CV-1、A549など他の細胞においても至適濃度や程度の差はあるものの同様の増大効果が認められた。
CAR（ADV受容体）の無いTHP-1細胞をSCH772984などのERK1/2阻害剤で前処理することでADVベクターによるEGFP発現を増大できた。ADVベクターによるEGFP遺伝子発現が困難なH2452細胞に、CAR付与試薬やCAR以外の受容体にADVを結合させる試薬を作用させたが、良好な結果は得られなかった。
糖添加時の高浸透圧による細胞死を抑制するために、塩化ナトリウム非含有培地を試したが細胞死の改善は限定的であった。陰圧下での培養は細胞死抑制に明白な好影響を与えなかった。SB203580やL-カルニチンでの処理も細胞死を抑制できなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ADVベクターによる外来遺伝子（EGFP遺伝子）発現に対する糖などの増大効果を調査した。すなわち，当初予定したA549細胞では、予定を超える104種類の添加物について検討することができた。その結果では、糖類とオスモライトでは増大効果が認められる一方で，アミノ酸は増大効果を有しなかった。従って，糖類とオスモライトのみが外来遺伝子発現増大効果を有する可能性が高いと示唆された。それに加えて、HepG2、NCTC2544、FL、PC3、MES-SA、A431、H28、211H、H2452、Vero、CV-1の各細胞で30種類の糖と2種類のオスモライトの外来遺伝子発現増大効果を調べることができたことは予定以上の進展であった。その結果，増大効果を発揮する糖の種類と濃度は対象とする細胞により異なることが判明した。
ポリカチン，特にDEAEデキストラン塩化水素でADVベクターを前処理することによって，ADVベクターによる外来遺伝子導入をより効率化できることが実証された。また，細胞表面にCARを発現しない，または少量しか発現しない細胞を，ERK1/2阻害剤で前処理することによって，CAR発現量を増やしてADVベクターによる遺伝子導入を促進できることも分かった。従って，これらの技術を組み合わせることにより，想定どおり糖の外来遺伝子発現増大効果を多くの哺乳動物細胞で有効に引き出せることが分かった。他方，CAR付与試薬やCAR以外の受容体にADVを結合させる試薬については更なる条件検討が必要と考えられる。
糖添加時の高浸透圧による細胞死を抑制する方法に関しては，塩化ナトリウム非含有培地，陰圧下での培養，SB203580やL-カルニチンでの細胞処理などを検討したが，良好な結果を得ることはできなかった。しかし，これも想定の範囲内であり，他の細胞死抑制試薬を検討する予定である。

Strategy for Future Research Activity

本年度は，ADVベクターを使用してヒトサイトメガロウイルス前初期（CMVIE）プロモーターで制御されたEGFP遺伝子を導入し，糖の外来遺伝子発現増大効果を実証した。20201年度は，予定通り，レンチウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターを用いてCMVIEプロモーター制御EGFP遺伝子を導入し，糖の外来遺伝子発現増大効果を調査する。また，2021年度は，ポリエチレンイミンを用いて、野生型ADVとプラスミドDNAの複合体を作り、組換えウイルス使用時と同様に高い効率で外来遺伝子を哺乳動物細胞に導入し，カルタヘナ条約に抵触しない方法で，糖による高い外来遺伝子発現を実現する予定である。
CAR付与試薬やCAR以外の受容体にADVを結合させる試薬について更なる条件検討を行い，糖の外来遺伝子発現効果と相加相乗的に効果を発揮するか否かを検討する予定である。
SB203580やL-カルニチン以外にも細胞死を抑制すると報告された薬剤は多数存在する。その中のPuerarin（酸化ストレス阻害剤），Pifithrin-alpha hydrobromide（p53阻害剤），N-Acetyl-L-cysteine（活性酸素種阻害剤），Y-39983 HCl（Rho関連リン酸化酵素阻害剤），Acetazolamide（炭酸脱水酵素阻害剤），MHY1485（mTOR活性化剤），Tyrphostin 23（上皮成長因子受容体阻害剤），U73122（ホスホリパーゼC阻害剤），PI-103（PI3リン酸化酵素阻害剤），Ceramide C-6（ERK活性化剤），及びGo 6976（蛋白質リン酸化酵素C阻害剤）について，高濃度の糖存在下での細胞死を抑制できるかどうかを検証する予定である。

Causes of Carryover

残額が1,273円と少額であったため，次年度の予算と一緒に使用した方が有効に使用できると判断したため。

2020年度に購入を予定しているレンチウイルスベクターやアデノ随伴ウイルスベクターは高価であるため，これらを購入する費用の足しとして使用する。