Establishment of technology to dramatically increase the expression of foreign genes introduced by viral vector

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K05165
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 荒尾 雄二郎 岡山大学, 保健学域, 教授 (40151146)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 外来遺伝子発現 / ウイルスベクター / 緑色蛍光蛋白質 / 糖 / オスモライト / ERK1/2阻害剤 / ポリカチオン

Outline of Annual Research Achievements

令和3年度は、強化型緑色蛍光蛋白質（EGFP）遺伝子を有するプラスミドを、ポリエチレンイミンを用いて非感染性アデノウイルス（ADV）5型に付着させることにより、ウイルスベクターと同様に高い効率でA549細胞に導入し、導入EGFP遺伝子に対する32種類の化合物の効果を調べた。なぜならば、ウイルスベクターは組換えウイルスであり、その使用はカルタヘナ条約で規制されている。規制の無い非感染性ウイルスを利用して外来遺伝子を発現させた場合でも、その発現を増大する化合物があることを確認する必要があるからである。9種類の糖が外来遺伝子発現を3倍以上に増大し、D-グルコースなどでは6から8倍の高発現が誘導できた。
研究期間全体では、比較的高いとされるウイルスベクターによる外来遺伝子発現を、糖などによる細胞状態の適正化によってさらに高度化する技術を開発した。すなわち、形質導入細胞を糖などの存在下で培養することで、ADVベクターによるEGFP遺伝子導入では蛍光強度を最大で12倍にすることが可能であった。また、アデノ随伴ウイルスベクターでの形質導入では最大で45倍の蛍光強度を実現可能であった。蛍光強度のみでなくEGFP量も増大していた。最大の増大効果を発揮する化合物の種類と濃度は細胞により異なっており、如何なる細胞にも大きな効果を示す化合物は見出せなかった。故に、細胞ごとに最適な化合物を選定する必要があった。さらに、糖などによる外来遺伝子発現増大効果を有効活用する技術を開発した。すなわち、糖の外来遺伝子発現増大効果を、DEAEデキストラン塩化水素によるウイルス表面負電荷の中和、及びERK1/2阻害剤（SCH772984）によるADV受容体（CAR）の誘導と組み合わせることで、THP-1細胞でのADVベクターによるEGFP蛍光発現を500倍以上に増強できた。